Preparazione e conservazione delle soluzioni

2.1 Soluzioni di esteri

Le soluzioni madre, in esano, acetonitrile ed etanolo, degli esteri salicilici e cinnamici sono state preparate per pesata in matraccio tarato, nell’intervallo di concentrazione 2000-5000

ppm. Sono state conservate a temperatura ambiente in vial di vetro chiaro con tappo a vite di plastica. Le soluzioni di lavoro sono state preparate per diluizione di quantità note di queste soluzioni.

Sono stati effettuati controlli periodici mediante spettrofotometria, andando a verificare i rapporti di intensità degli assorbimenti UV misurati a diverse lunghezze d’onda (Appendice 1, 2.3 e 2.4), per verificare sia il titolo, sia la presenza di eventuali processi degradativi. L’analisi dei rapporti di banda ha evidenziato come, anche conservando a T ambiente, le soluzioni di esteri fossero estremamente stabili anche per più anni, in tutti i solventi utilizzati. L’analisi quantitativa ha anche mostrato che le soluzioni in etanolo od acetonitrile mantenevano il proprio titolo anche per lunghi periodi, mentre quelle esaniche si concentravano in tempi molto brevi, ed andavano standardizzate ad ogni utilizzo, sempre per analisi spettrofotometrica. Questo fenomeno è stato attribuito all’evaporazione dell’esano.

2.2 Soluzioni di acidi organici e CAPE

Le soluzioni madre di acidi benzoici e cinnamici e dell’estere CAPE, in acetonitrile ed etanolo, sono state preparate per pesata in matraccio tarato, nell’intervallo di concentrazione 2000-5000 ppm. La dissoluzione dell’acido caffeico in solvente organico puro è estremamente difficoltosa, per cui gli standard sono stati preparati in solvente organico, con l’aggiunta di 10 % di acqua (volume rispetto al valore finale), prima della portata a volume. L’aggiunta anche di minime quantità di acqua al solvente organico dissolve immediatamente tutto l’acido caffeico presente. Le soluzioni di lavoro sono state preparate per diluizione di quantità note di queste soluzioni.

Sono stati effettuati controlli periodici mediante spettrofotometria, andando a verificare i rapporti di intensità degli assorbimenti UV misurati a diverse lunghezze d’onda (Appendice 1, 2.1, 2.2 e 2.4), per verificare sia il titolo, sia la presenza di eventuali processi degradativi. Le soluzioni di acido caffeico e CAPE si sono rivelate estremamente instabili a temperatura ambiente, e per questo sono state conservate a -18 °C, temperatura a cui sono risultati stabili per lunghi periodi. Le soluzioni diluite di lavoro devono essere usate contestualmente alla loro preparazione, e devono essere scartate alla fine della giornata. Questo dato è congruente con quanto riportato in letteratura, dove la bassa stabilità di questi composti è dovuto alla facilità di ossidazione della funzione ortodifenolica a chinoni [4]. Le soluzioni degli altri acidi

benzoici e cinnamici erano stabili a T ambiente per pochi giorni. Per questo motivo, erano preparate immediatamente prima del loro utilizzo, ed eventualmente rinnovate ogni settimana, secondo le esigenze della sperimentazione.

2.3 Soluzioni di flavonoidi

Le soluzioni madre in etanolo dei flavonoidi sono state preparate per pesata nell’intervallo di concentrazione 400-2000 ppm in matracci da 5 mL. Poiché le quantità disponibili nelle confezioni commerciali era pari a 5 mg, la pesata è stata fatta con una bilancia a 5 cifre (Parte sper., 5.5). Le specie sono risultate però poco solubili in etanolo, e quindi sono state preliminarmente dissolte in 500 µL di DMSO, ottenendo una dissoluzione istantanea. Le soluzioni sono quindi diluite e portate a volume con etanolo, e conservate a -18 °C per la durata della sperimentazione. Le soluzioni di lavoro sono state preparate per diluizione di quantità note di queste soluzioni.

Sono stati effettuati controlli periodici mediante spettrofotometria, andando a verificare i rapporti di intensità degli assorbimenti UV misurati a diverse lunghezze d’onda (Appendice 1, 2.5), per verificare sia il titolo, sia la presenza di eventuali processi degradativi. Con il metodo di conservazione scelto, le soluzioni si sono mantenute stabili per diversi mesi.

2.4 Soluzioni di alcoli aromatici

Le soluzioni standard di alcol benzilico e 2-fenil etanolo in EtOH sono state preparate al 10 % circa per pesata in apposito matraccio. Le soluzioni standard di alcol cinnamico sono state preparate in ACN a 2000 ppm circa, per pesata in apposito matraccio. Le soluzioni di lavoro sono state preparate per diluizione di quantità note di queste soluzioni. Le soluzioni sono state conservate a temperatura ambiente in vial di vetro chiaro con tappo a vite di plastica.

Il controllo spettrofotometrico di stabilità (Appendice 1) ha evidenziato che la soluzione di alcol benzilico (Appendice 1, 2.6) è soggetta a processi degradativi, e deve quindi essere preparata contestualmente alla sperimentazione. Le soluzioni degli altri alcoli sono stabili a T ambiente (Appendice 1, 2.6).

2.5 Soluzioni di controllo per HPLC

Soluzioni di naftalene, toluene e acetofenone sono state preparate per il controllo dell’efficienza delle colonne cromatografiche HPLC. Una soluzione madre era preparata pesando le tre specie in un matraccio, e dissolvendo con acetonitrile o metanolo. Il rapporto di concentrazioni in ppm di acetofenone, toluene e naftalene era 1/10/1 rispettivamente, per ottenere picchi di intensità comparabile, tenuto conto della differenza di sensibilità tra le tre specie alla lunghezza d’onda di rivelazione (254 nm). Le soluzioni di lavoro erano ottenute per diluizione di questa soluzione nella miscela eluente usata per la prova di controllo (Parte sper., 5.1).

2.6 Altre soluzioni

Le soluzioni acquose di acidi minerali sono state preparate per diluizione in opportuno matraccio della quantità necessaria del prodotto azeotropico commerciale. Le soluzioni acquose e metanoliche di sali e basi sono state preparate per pesata in opportuno matraccio.

La soluzione acquosa a pH 5.5, usata nel trattamento della propoli per la determinazione dell’acido salicilico (Parte sper., 6.2.1.2), è stata preparata come segue. In un matraccio da 100 mL, si pesavano 2.78 g di NaH2PO4*H2O, e si scioglievano in acqua. Si aggiungevano

quindi 17 mL circa di una soluzione 86 mM di KOH. Si portava a volume con acqua. Il pH di questa soluzione è stato misurato con il pHmetro, e a 19 °C era pari a 5.4.

Le soluzioni di TPTZ sono state preparate per pesata in matracci da 25 mL, in modo da avere una concentrazione finale di 10 mM circa. Il chelante è stato disciolto con una soluzione 40 mM di HCl.

Le soluzioni di Fe (II) sono state preparate in matraccio da 25 mL per pesata di ferro (II) cloruro tetraidrato, in modo da avere una concentrazione finale di Fe (II) di circa 10 mM. Le soluzioni di Fe (III) sono state preparate per pesata del ferro (III) cloruro esaidrato, in modo da avere una concentrazione finale in Fe (III) di 20 mM circa. Il sale di Fe (III) è stato disciolto in HCl 40 mM.

Il reattivo del Fe (III) per le prove di potere antiossidante era preparato giornalmente. In un matraccio da 25 mL, si aggiungevano 2.1 mL della soluzione acida di Fe (III) e 2.1 mL della soluzione di TPTZ. Si portava a volume con un tampone acetico (rapporto molare CH3COONa/CH3COOH =0.084, pH = 3.7) [89].

Le soluzioni di 2,4 dinitrofenil idrazina sono state preparate come segue. In un matraccio da 25 mL, si pesavano circa 500 mg di idrazina e si sospendevano in circa 20 mL di MeOH. Si aggiungevano poi, goccia a goccia, 500 µL di acido solforico concentrato, e in conseguenza di tale aggiunta l’idrazina si scioglieva completamente. La soluzione era portata a volume con MeOH [38].