5. Materiali e Metodi
5.7 Analisi statistica
I dati riportati sono stati espressi come valore medio ± DS, se non altrimenti specificato. Dopo la verifica della distribuzione normale dei vari parametri, i confronti tra i gruppi sono stati effettuati con il test ANOVA. L’esistenza di una relazione tra i vari parametri presi in esame è stata analizzata con il test della correlazione multivariata e della regressione multipla. I valori di OR sono stati calcolati utilizzando l’analisi di contingenza. È stato considerato statisticamente significativo un valore di p<0,05. L’analisi statistica è stata elaborata utilizzando il software JMP versione 12 (SAS Institute Inc, Cary, NC, USA).
6. Risultati
Applicando le analisi statistiche precedentemente descritte ai dati derivanti dall’applicazione del protocollo di studio, alcuni dei risultati emersi presentano differenze significative tra il gruppo dei controlli e quello degli obesi (le p significative sono segnate in corsivo nelle figure successive).
Dalla misurazione della pressione arteriosa, è emerso che ci sono differenze significative nella pressione arteriosa diastolica (p=0,0025), ma non sistolica (fig. 16).
Figura 16 Pressione Arteriosa Sistolica e Diastolica nei controlli e negli obesi
40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 PAS PAD mmH g
Pressione Arteriosa
Controlli Obesi p=0,0025 p=0,38Dalla misurazione degli AGEs è emerso che non ci sono differenze statisticamente significative, ma nei soggetti obesi c’è un trend ad avere valori più elevati (fig. 17).
Figura 17 Contenuto cutaneo degli AGEs nei controlli e negli obesi
Dalla valutazione della funzione endoteliale mediante PAT è emerso che non ci sono differenze statisticamente significative tra i due gruppi (fig. 18).
Figura 18 RHI misurato mediante endo-PAT nei controlli e negli obesi
1 1,25 1,5 1,75 2 AF (u n ità a rb itra ria)
AGEs
Controlli Obesi 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3RHI
Controlli Obesi p=0,11 p=0,75Dall’analisi mediante flussimetria Doppler è emerso che la differenza dell’area sotto la curva dopo lo stimolo ischemico è statisticamente significativa tra i due gruppi in esame, con p=0,0048 (fig. 21). In particolare, i soggetti obesi presentano un’area ridotta. Altra differenza significativa la si ha a livello della perfusione basale con p=0,0075 (fig.19), dell’area sotto la curva prima dello stimolo con p=0,018 (fig. 21) e dell’incremento percentuale del picco con p=0,034 (fig. 20). Gli altri dati, come il picco di perfusione iperemico (fig. 19) e l’incremento % dell’AUC (fig. 22), non presentano differenze significative, invece.
Figura 19 Perfusione basale e picco di perfusione iperemico con laser-Doppler
Figura 20 Incremento % del picco iperemico con laser-Doppler
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130
Perfusione basale Picco di perfusione iperemico
PU
Laser Doppler (1)
Controlli Obesi 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 %% incremento del picco iperemico
Laser Doppler (2)
Controlli Obesi
p=0,2
p=0,0075
Figura 21 AUC prima dello stimolo ischemico e dopo lo stimolo ischemico
Figura 22 Incremento % dell'area sotto la curva laser-Doppler
0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 A re a so tt o la cu rva p o st-s ti mo lo A re a so tt o la cu rva p re -s ti m o lo PU x secondi
Laser Doppler (3)
Obesi Controlli 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 % % incremento AUCLaser Doppler (4)
Controlli Obesi p=0,018 p=0,0048 p=0,18Analizzando la presenza di eventuali correlazioni tra i dati auxologici e quelli del microcircolo, risulta che sia la perfusione basale, sia l’AUC pre-stimolo che quella post-stimolo, correlano significativamente in modo inverso con (tabella 3):
- il BMI-SDS;
- il rapporto tra la circonferenza vita e l’altezza (CV/h); - la massa grassa (%).
Mentre con l’età decimale, con la statura-SDS e con la massa muscolare (kg) le correlazioni non sono risultate significative.
In particolare:
Correlazione bivariata tra dati auxologici e microcircolo
R T p PERFUSIONE BASALE Età decimale 0,1 0,70 0,49 BMI-SDS 0,44 -3,12 0,0034 CV/h 0,45 -3,25 0,0024 Statura-SDS 0,1 0,68 0,50 Massa muscolare (kg) 0,08 0,48 0,64 Massa grassa (%) 0,52 -3,88 0,0004 AREA PRE-STIMOLO Età decimale 0,09 0,58 0,58 BMI-SDS 0,39 -2,73 0,0093 CV/h 0,41 -2,89 0,0062 Statura-SDS 0,1 0,85 0,39 Massa muscolare (kg) 0,1 0,65 0,52 Massa grassa (%) 0,49 -3,56 0,0010 AREA POST-STIMOLO Età decimale 0,08 0.51 0,61 BMI-SDS 0,45 -3,19 0,0028 CV/h 0,45 -3,22 0,0025 Statura-SDS 0,22 1,48 0,14 Massa muscolare (kg) 0,1 0,76 0,44 Massa grassa (%) 0,55 -4,24 0,001
Inoltre, inserendo le variabili che correlavano significativamente in un modello di regressione lineare multipla, è stato possibile osservare che la massa grassa (%) è una variabile indipendente della diminuzione dell’area sotto la curva Doppler registrata nel post-stimolo: con l’aumento della massa grassa diminuisce tale area (tabella 4). La massa grassa (%) ha dimostrato una tendenza verso una debole significatività come variabile indipendente dell’area registrata prima dello stimolo (tabella 4).
Regressione multipla per l’area sotto la curva pre-stimolo e post-stimolo
Stima (DS) T p AREA POST-STIMOLO Intercetta 3476,77 ± 7649,45 0.45 0,6520 BMI-SDS -258,93 ± 927,45 -0,28 0,7816 CV/h 171198,34 ± 19898,29 0,86 0,3928 Massa grassa (%) -215,37 ± 82,33 -2,62 0,0127 AREA PRE-STIMOLO Intercetta 2283,66 ± 207,97 1,10 0,2771 BMI-SDS 24,67 ± 251,04 0,10 0,9223 CV/h 15553,60 ± 5387,15 0,29 0,7746 Massa grassa (%) -43,25 ± 22,29 -1,94 0,0598
Tabella 4 Modello di regressione lineare multipla per AUC pre-stimolo e post-stimolo
Utilizzando l’analisi di contingenza, considerando la mediana dei valori riscontrati nei controlli per l’AUC pre-stimolo e post-stimolo (rispettivamente 2281 PU x secondi, 7072 PU x secondi), è stato possibile osservare che:
- il rischio per un soggetto obeso di avere una riduzione dell’area pre-stimolo è 5,82 volte superiore rispetto al controllo;
- il rischio per un soggetto obeso di avere una riduzione dell’area post-stimolo è 9,27 volte superiore rispetto al controllo.
7. Discussione
In questo studio sono stati analizzati gli eventuali effetti dell’eccesso ponderale sul sistema vascolare.
La pressione arteriosa diastolica è risultata significativamente più elevata nei soggetti obesi, ma soltanto in uno di essi il valore era nell’ambito della pre-ipertensione per età, sesso e statura. La pressione arteriosa sistolica, invece, non è risultata significativamente più alta rispetto ai controlli senza eccesso ponderale.
Questo aumento pressorio è in accordo con altri risultati emersi dalla letteratura scientifica, precedentemente descritta66.
L’aumento della pressione potrebbe derivare, come già specificato:
- dall’insulino-resistenza, per la diminuzione dell’NO derivante dall’inibizione della PI3K e aumento relativo dell’endotelina vasocostrittrice tramite la ERK1/2;
- dal tono simpatico aumentato, derivante dalla leptina aumentata, che ha azione vasocostrittrice, e dall’adiponectina ridotta, che invece contribuisce all’attivazione di eNOS;
- dalla diminuzione della sensibilità dei barocettori;
- dall’attivazione del sistema renina-angiotensina-aldosterone, per produzione da parte del tessuto adiposo di angiotensinogeno.
Il controllo dei valori pressori ha importanza in quanto la presenza di ipertensione in età evolutiva rappresenta un fattore di rischio per quella in età adulta65.
L’aumento della pressione arteriosa diastolica potrebbe essere specchio di un danno, almeno iniziale, nel sistema vascolare. Il fatto che la pressione arteriosa sistolica non sia risultata significativamente aumentata, nonostante la letteratura indichi il contrario, potrebbe derivare dalla numerosità ridotta del campione e dalla giovane età.
Dalla misurazione cutanea degli AGEs non sono emerse differenze significative, ma è presente comunque un trend verso valori più elevati nei soggetti obesi rispetto ai controlli.
Questa mancata differenza, che invece in letteratura è stata evidenziata, dal momento che gli AGEs sono coinvolti nei processi infiammatori che sono ben rappresentati nei soggetti obesi, anche se non sempre negli adolescenti come già specificato, potrebbe derivare, oltre che dalla limitata numerosità del campione, anche dal fatto che i livelli cutanei degli AGEs riflettono sia la produzione endogena che esogena. Quella endogena è legata, come già descritto, a condizioni di stress ossidativo, iperglicemia e insulino-resistenza, mentre quella esogena al tipo di alimentazione e al fumo di sigaretta (i soggetti reclutati non erano fumatori). Di conseguenza potrebbe essere che i controlli, seppur sani e normo-peso, seguissero un’alimentazione non propriamente sana e corretta, oppure che alcuni soggetti tra quelli obesi, essendo già pazienti ambulatoriali, avessero modificato il loro stile alimentare verso un regime più corretto.
Anche la valutazione della funzione endoteliale mediante PAT, non ha mostrato differenze significative nel valore di RHI. Come già specificato, pochi studi sono stati fatti con questa tecnica prendendo in esame la fascia pediatrica. Dato che nel paziente obeso è stata descritta una diminuita funzione endoteliale, tale indice dovrebbe essere diminuito nei soggetti obesi rispetto ai controlli. Come già descritto, infatti, nel paziente obeso sia l’insulino-resistenza, sia le alterazioni del profilo lipidico (le LDL interferiscono con eNOS), sia il disequilibrio tra le EPC (Endothelial Progenitor Cells) e le EMP (Endothelial MicroParticles), a favore di queste ultime, sia la riduzione delle CAC (Circulating Angiogenic Cells), sia lo stato infiammatorio indotto dalla produzione di molecole proinfiammatorie da parte del tessuto adiposo viscerale, contribuiscono a interferire con la funzione endoteliale.
È possibile che nei pazienti obesi arruolati, anche per la loro giovane età, queste alterazioni non si siano ancora strutturate in misura tale da essere valutabili con la tecnica utilizzata.
La valutazione del microcircolo tramite flussimetria laser-Doppler ha invece messo in evidenza alcune differenze significative.
Infatti, la perfusione basale risulta minore nei soggetti obesi, probabilmente per l’ipertono simpatico caratteristico del paziente obeso. Anche l’area sotto la curva laser- Doppler prima dello stimolo ischemico, che riflette in modo ancora più globale la
perfusione del soggetto in condizioni basali, risulta significativamente più bassa in questi soggetti.
Il picco iperemico, invece, non presenta differenze significative. Questo dato, comunque, è semplicemente una misura istantanea della perfusione, in particolare definisce il valore massimo che essa raggiunge durante l’iperemia.
La percentuale di incremento del picco è, invece, risultata significativamente maggiore nei soggetti obesi rispetto ai controlli. Questo dato è dovuto al fatto che gli obesi hanno, come già osservato, un valore minore di perfusione basale. Questo comportamento è stato riportato anche nei pazienti adulti obesi100.
Un dato importante riguarda, invece, il valore assoluto dell’area sottesa dalla curva laser-Doppler dopo lo stimolo ischemico, risultato significativamente ridotto nel gruppo degli obesi rispetto ai soggetti di controllo. Come già più sopra riportato, la AUC riflette l’andamento globale della reattività microvascolare. Tale risultato esprime, dunque, un’alterata risposta sia miogenica sia endoteliale all’ischemia85,105. La tecnica laser-Doppler studia maggiormente la prima componente, ma questo parametro, tra quelli analizzati dalla metodica, è quello che descrive maggiormente anche la seconda.
L’incremento percentuale dell’area non presenta differenze significative, poiché gli obesi hanno una perfusione, con relativa area sottesa, minore.
In letteratura ci sono pochi lavori sull’adolescente obeso, se non uno studio105 con 41 adolescenti obesi e 91 controlli, che mostra invece differenze significative nel picco iperemico, con un picco maggiore nel ragazzo obeso.
Questa metodica trova giustificazione nel suo impiego anche in altri ambiti, non solo nell’obesità:
- nel soggetto adulto iperteso è stato riscontrato un ridotto incremento % del picco99, soprattutto se iperteso da lungo tempo oppure senza un trattamento
efficiente85;
- nel soggetto adulto fumatore la perfusione basale è significativamente più bassa rispetto ai controlli e l’incremento % dell’AUC è minore106.
Questi lavori indicano l’uso della metodica laser-Doppler per valutare lo stato del microcircolo nel paziente, ma sono necessari ulteriori studi, soprattutto in età evolutiva.
Il fatto che la funzione endoteliale valutata mediante PAT non risulti alterata, mentre ci sia una alterazione nel microcircolo valutato mediante laser-Doppler, potrebbe suggerire che la risposta miogenica si altera prima di quella endoteliale o che comunque il danno miogenico che si genera è maggiore o che la metodica Doppler è più sensibile.
L’alterazione potrebbe essere determinata da un danno infiammatorio oppure autonomico, alterazioni comunque descritte nel paziente obeso, anche pediatrico.
Infatti, come precedentemente specificato:
- l’obesità è connessa ad una diminuzione del tono parasimpatico e ad un aumento di quello simpatico;
- nel paziente obeso si instaura la cosiddetta “adiposopathy”, con attivazione di processi infiammatori ed aumento quindi di chemerina, pentrassina, leptina, IL6, PCR, TNF-alfa e diminuzione dell’adiponectina e del CNP.
Effettuando ulteriori analisi statistiche, sono state evidenziate alcune correlazioni inverse statisticamente significative. In particolare, la perfusione basale, l’area sottesa la curva Doppler prima dello stimolo ischemico e anche quella registrata dopo, durante la fase dell’iperemia reattiva, sono correlate sia con il BMI-SDS, sia con il rapporto tra la circonferenza vita e l’altezza (che, come precedentemente descritto, è indicativo di un rischio metabolico ulteriore), che con la massa grassa espressa in %.
In particolare, è quest’ultima che contribuisce a determinare, in modo statisticamente significativo, la diminuzione dell’AUC durante l’iperemia reattiva. La massa grassa (%) mostra invece, una tendenza verso una debole significatività come variabile indipendente dell’area registrata prima dello stimolo.
Valutando il valore di OR, il fatto di essere obeso, per un adolescente, implica un rischio 5,82 volte superiore, rispetto ad un coetaneo normopeso, di avere una diminuzione dell’AUC prima dello stimolo ischemico e un rischio 9,27 volte superiore di avere una diminuzione dell’AUC post-stimolo ischemico.
Vista la giovane età dei pazienti, seppur obesi, queste alterazioni del microcircolo possono essere reversibili: come già specificato, la perdita di peso può portare a benefici nel sistema vascolare59, compresa la funzionalità del microcircolo57,63,79.
Questo studio presenta dei limiti principalmente dovuti alla numerosità del campione preso in esame, causando difficoltà nell’analisi statistica. Un altro limite è quello che alcuni soggetti obesi avevano già iniziato a modificare i loro stili di vita prima di essere arruolati in questo studio. Questo potrebbe aver attenuato eventuali alterazioni vascolari.
Il presente studio, comunque, sottolinea l’importanza dell’analisi del microcircolo anche in età evolutiva, visto che rappresenta un indice predittivo di eventi cardiovascolari futuri64.
È importante sottolineare che le alterazioni del microcircolo, osservate nel presente lavoro di tesi, e quelle della funzione endoteliale, costituiscono lo stadio iniziale, ancora a livello pre-clinico, del processo aterosclerotico.
Questo suggerisce l’importanza della prevenzione in età evolutiva, indicando che l’adozione di stili di vita corretti può prevenire, in questi pazienti, l’instaurarsi di complicanze vascolari irreversibili, legate alla loro condizione di obesità.
8. Conclusioni
In questo studio sono stati valutati gli effetti sul sistema vascolare indotti dall’eccesso ponderale, confrontando adolescenti obesi con adolescenti normo-peso di pari età e sesso.
È emerso che la funzione endoteliale, analizzata con la tecnica della PAT, non presenta alterazioni significative, come anche la misurazione degli AGEs cutanei, mentre il microcircolo, analizzato con flussimetria laser-Doppler, mostra alterazioni nella reattività microvascolare, espressa dalla riduzione del parametro AUC dopo stimolo ischemico.
Sarà anche importante valutare, in futuro, l’effettiva reversibilità di quest’alterazione durante la terapia comportamentale dell’obesità ed il miglioramento dello stile di vita. Un altro aspetto interessante potrebbe essere rappresentato dalla valutazione di quanto lo stato infiammatorio e il sistema autonomico possano contribuire alle alterazioni del microcircolo.
Il fatto che le disfunzioni non siano severe e irreversibili è legato all’età dei pazienti: si tratta di giovani adolescenti ancora in fase evolutiva. Ciò sottolinea l’importanza della prevenzione delle complicanze dell’obesità e dell’obesità stessa, richiamando l’attenzione verso l’adozione di stili di vita sani.
Questo studio, nonostante il limite di un campione di dimensione contenute, indica che l’analisi del microcircolo può contribuire a definire la presenza di alterazioni vascolari in fase pre-clinica, ancora reversibili negli adolescenti obesi.
La disfunzione del microcircolo e dell’endotelio rappresentano, infatti, le prime tappe nella progressione del danno vascolare e del processo aterosclerotico.
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