Annessina A1 e migrazione cellulare

L‟actina citoscheletrica è una struttura flessibile costituita di monomeri di actina polimerizzati che possono essere rapidamente ristrutturati per svolgere diverse funzioni cellulari come la motilità, l‟endocitosi e la citochinesi. La regolazione delle dinamiche dell‟actina coinvolge l‟attività coordinata di numerose proteine tra cui alcuni membri della superfamiglia delle annessine, che in questa regolazione giocano un ruolo cruciale. Benché la funzione di queste proteine nel processo di rimodellamento dell‟actina non sia ancora compresa a livello meccanicistico, è chiaro che queste proteine hanno proprietà biologiche tali da poter integrare le vie di segnalazione legate allo ione calcio con i movimenti dell‟actina a livello dei punti di contatto con le membrane. Molte annessine, ad esempio, hanno dimostrato, almeno in modelli sperimentali in vitro, di essere in grado di interagire direttamente con actina polimerizzata confermando i loro proposti ruoli nella modulazione, stabilizzazione e/o regolazione delle interazioni actina-membrane (Hayes et al., 2004) (Fig. 5.6).

Anche ANXA1 è in grado di legare i filamenti di actina in maniera Ca2+-dipendente benché sembrino necessarie per questo legame, elevate concentrazioni di calcio (Glenney et al., 1987; Schlaepfer & Haigler, 1987). Un‟interazione diretta con l‟isoforma dell‟actina G-actina è stata dimostrata per ANXA5. Questo evento potrebbe essere di particolare importanza nelle piastrine, dove ANXA5 è molto abbondante e rimodella il citoscheletro in risposta a un aumento delle concentrazioni di calcio (Tzima et al., 2000). Resta da chiarire se e come questo evento sia correlato a un cambiamento della forma o della secrezione granulare delle piastrine.

La polimerizzazione dell‟actina, come detto in precedenza, è un evento coinvolto in moltissimi aspetti della biologia cellulare. L‟associazione dell‟actina nei punti di contatto cellula-cellula, le adesioni focali e le proteine che legano la matrice extracellulare come le integrine, mantengono la connettività delle cellule con le membrane e con le cellule vicine nei tessuti. Il rimodellamento dinamico dell‟actina è associato alla fagocitosi, alla pinocitosi, alla citocinesi, all‟endocitosi e all‟esocitosi, alla formazione di fillopodi e lamellopodi e alla migrazione. Le annessine sono state spesso identificate in studi di genomica e proteomica, nei compartimenti sub-cellulari coinvolti in questi processi ma i loro ruoli precisi sono difficili da definire.

Figure 5.6 Rappresentazione schematica delle interazioni tra annessina e actina. A: Endosoma nascente;

B: Fosfatidili-inositolo-4,5-bifosfato; C: Annessina monomerica associata con filamenti di actina; D: Complessi eterotetramerici e 2/p11 collegati con filamenti di actina; E: Filamenti di actina; F: Interazioni di recettori extracellulari accoppiati a protein G; G: Fosfatidil-inositolo-chinasi che generano inositol-fosfolipidi; H: Macropinosomi; I: Assocoazioni dell‟annessina con fillopodi ricchi in actina; J: Annessina associata con strutture membrana-citoscheletro nei fagosomi; K: Il trasporto di monomeri di actina tra annessina e proteine che sequestrano l‟actina come la profilina può regolare la concentrazione effettiva di G-actina libera.

La capacità delle annessine di legare sia i fosfolipidi carichi negativamente sia la superficie interna della membrana plasmatica sia il citoscheletro, suggerisce un ruolo per le annessine nell‟organizzazione dei domini membrana-citoscheletro. Nonostante il legame delle annessine con F-actina sia stato uno dei primi eventi descritti per annessina A1 e A2, l‟importanza e il significato biologico di questa proprietà resta difficile da stabilire non in ultimo perché, generalmente, queste annessine non co- localizzano con i filamenti di actina nelle cellule. Ciò che sta divenendo chiaro è che annessina A2 ad esempio, è richiesta nei siti di polimerizzazione dell‟actina che sono intimamente associati alle superfici di membrana e che l‟interferenza con le funzioni dell‟ANXA2 può generare il fallimento di certi tipi di polimerizzazione dell‟actina. Lo scopo ora è quello di comprendere il ruolo di annessina A2 a livello meccanicistico.

Dato il gran numero di proteine già note per essere coinvolte nella regolazione del rimodellamento dell‟actina, come le proteine CAP, le proteine di separazione, le proteine di nucleazione e quelle di ramificazione, sarebbe particolarmente interessante scoprire il posto occupato dalle annessine in questo complesso macchinario molecolare (Hayes et al., 2004).

La possibile implicazione dell‟ANXA1 nell‟organizzazione del citoscheletro è supportata, come abbiamo detto, dalla sua capacità di legare F-actina e profilina, proteina importante nella polimerizzazione dell‟actina. È stato dimostrato che la proteina si accumula insieme a F-actina a livello delle strutture di movimento come lamellopodi e fillopodi e nei punti di contatto cellula-cellula in alcuni modelli cellulari come ad esempio nelle cellule di fegato di ratto durante la formazione transiente delle stress fiber in risposta ad una stimolazione con EGF. Il legame tra ANXA1 e actina osservato in vitro sembra essere correlato alla co-localizzazione della proteina con F-

actina a livello dei ripiegamenti della membrana plasmatica indotti dall‟EGF (Campos- Gonzalez et al., 1990; Kusumawati et al., 2000).

ANXA1 potrebbe influenzare la polimerizzazione dell‟actina mediante interazione diretta con la profilina. Benchè quest‟interazione non sia stata dimostrata in vitro, essa potrebbe modulare sia la capacità di legame di annessina A1 con i fosfolipidi di membrana sia gli effetti della profilina sulla polimerizzazione dell‟actina (Alvarez- Martinez et al., 1996; Alvarez-Martinez et al., 1997).

Esistono diverse evidenze in letteratura circa gli effetti dell‟annessina A1 sui processi di migrazione e invasione cellulare.

I dati ottenuti da Solito et al. nel 2000 indicano ad esempio, che ANXA1 può mediare l‟inibizione della migrazione dei monociti attraverso l‟endotelio e che questa inibizione è parte delle azioni anti-infiammatorie della proteina (Solito et al., 2000). Tra le varie classi di leucociti presenti nel sangue periferico, sia i polimorfonucleati sia i monociti, infatti, contengono quantità molto elevate di ANXA1 (Perretti et al., 1996; Goulding et al., 1990). Nella linea cellulare di monociti U937 quando queste cellule differenziano in macrofagi, aumentano i livelli di espressione di ANXA1 (Solito et al., 1991) e il trattamento con glucocorticoidi di U937 differenziate induce la traslocazione della proteina alle membrane cellulari (Solito et al., 1994). L‟adesione dei monociti all‟endotelio vascolare durante l‟infiammazione è un evento cruciale che precede il reclutamento di queste cellule nei tessuti extravascolari (Luscinskas et al., 1996). Al fine di valutare il ruolo di ANXA1 nel processo di adesione dei monociti all‟endotelio microvascolare umano Solito et al. (2000) hanno caratterizzato i meccanismi molecolari alla base di questo evento. Gli autori hanno dimostrato che sia l‟annessina A1 esogena sia quella endogena sono in grado di inibire l‟adesione delle cellule U937 all‟endotelio vascolare probabilmente mediante interazione con l‟integrina α4β1.

Le cellule tumorali di glioma sono più o meno invasive in funzione dello stadio di sviluppo neoplastico. Esse migrano in risposta a certi fattori di crescita come EGF (Brockmann et al., 2003; Lamszus et al., 1998). Le cellule di glioma si muovono preferenzialmente attraverso gli spazi interstiziali formati nella materia bianca dagli assoni e dai processi gliali e ampliati dall‟edema e dalla proteolisi indotte dal tumore. Una volta che lo sviluppo embrionale del cervello è completo, la maggior parte degli astrociti normali mantiene contatti vascolari stabili e non migra, ad eccezione di occasionali e limitati movimenti cellulari durante alcuni tipi di gliosi reattiva. Gli astrociti normali hanno generalmente una forma stellata dovuta a sottili estensioni citoplasmatiche stabilizzate da interazioni con il sistema vascolare e con altre cellule (Derouiche & Frotscher, 2001). Al contrario, le cellule tumorali producono estensioni cellulari pseudopodiali dinamiche che mediano la migrazione con contatti vascolari e neuronali solo transitori. Trasduzione dei segnali, formazione e ricambio di membrane cellulari, rimodellamento del citoscheletro, adesione e de-adesione, produzione di energia, sono eventi che avvengono all‟interno delle protrusioni pseudopodiali durante l‟invasione tumorale. Le proteine coinvolte nella mediazione dell‟estensione degli pseudopodi offrono potenziali bersagli terapeutici per la soppressione dell‟invasione tumorale. Nel 2005 Beckner et al. hanno eseguito studi di proteomica su pseudopodi isolati da cellule umane di glioma maligno U87 in attiva migrazione, al fine di ottenere informazioni sufficienti sulla quantità e la qualità di proteine presenti in queste strutture. Gli autori hanno dimostrato un aumento, a livello degli pseudopodi, di diverse proteine tra cui ANXA1 e hanno concluso che tali proteine possono essere considerate potenziali bersagli per la soppressione dell‟invasività nei gliomi (Beckner et al., 2005).

È stato dimostrato che ANXA1 è associata allo sviluppo di metastasi in alcuni tumori epiteliali a carattere invasivo, anche se il ruolo di ANXA1 nella

migrazione/invasione delle cellule epiteliali non è noto. Babbin et al. (2006) hanno analizzato il ruolo di ANXA1 nei processi d‟invasione in un modello cellulare epiteliale, le SKCO-15, derivanti da adenocarcinoma del colon-retto. La soppressione dell‟espressione di ANXA1 mediante siRNA ha generato una riduzione del grado d‟invasività. Studi della localizzazione hanno rivelato una traslocazione alla membrana plasmatica di ANXA1 in condizioni d‟induzione alla migrazione, mentre l‟inibizione funzionale dell‟ANXA1 delle superfici cellulari mediante somministrazione di un anticorpo bloccante l‟annessina, ha ridotto significativamente la migrazione cellulare. Al contrario, l‟invasività delle cellule SKCO-15 aumenta di circa due volte in presenza del full-lenght dell‟ANXA1 e del suo derivato amino-terminale Ac2-26. Gli autori, ipotizzando un coinvolgimento dei recettori FPR nella regolazione della migrazione da parte di ANXA1, com‟era già stato dimostrato nella migrazione dei leucociti (Perretti et al., 1996), hanno esaminato l‟espressione di FPR-1, FPR-2 e FPR-3 nelle cellule SKCO-15 mediante RT-PCR. Il trattamento delle cellule SKCO-15 con ANXA1 ricombinante, Ac2-26 e un agonista del recettore FPR, fMLP, ha indotto rilascio del calcio intracellulare e quindi l‟attivazione del recettore. Inoltre, gli antagonisti di FPR, Boc2, hanno annullato il rilascio di calcio intracellulare indotto da ANXA1 e dai suoi derivati e incrementato l‟invasività delle cellule SKCO-15. Gli autori hanno concluso che nella linea cellulare epiteliale SKCO-15 esiste un ruolo autocrino/paracrino per ANXA1 di membrana nella stimolazione della migrazione di tali cellule e che quindi la proteina ha un ruolo cruciale nei processi di metastatizzazione dell‟adenocarcinoma del colon-retto (Babbin et al., 2006).

Nel tentativo di identificare i meccanismi coinvolti nella metastatizzazione del melanoma, Rondepierre et al. (2009) hanno effettuato studi comparativi di proteomica in due linee cellulari di melanoma, le B16F10 e le B16B16, e nei tumori primari singenici derivanti, come le metastasi polmonari generate dal melanoma B16B16. Le analisi effettutate hanno identificato variazioni dell‟espressione di 6 proteine in vitro e di 13 proteine in vivo. Due di queste proteine diversamente espresse, ANXA1 e CKB, sono state identificate sia nelle due linee cellulari sia nei tumori singenici. Per caratterizzare il coinvolgimento di ANXA1 nella disseminazione del melanoma B16, gli autori hanno ridotto l‟espressione della proteina mediante siRNA e osservato una riduzione significativa dell‟invasività della linea cellulare B16B16. Essi hanno dimostrato inoltre, la presenza dei recettori FPR, FPR-1 e FPR-2 e un ruolo cruciale per tali recettori nei processi d‟invasione delle cellule B16 correlato ai livelli di espressione di ANXA1: gli autori hanno ipotizzato che il legame tra ANXA1 e i recettori per il formil peptide potrebbe amplificare gli eventi d‟invasione e quindi incrementare la disseminazione del melanoma (Rondepierre et al., 2009).

Nel 2010 de Graauwa et al. hanno valutato se ANXA1 fosse in grado di regolare il fenotipo a carattere mesenchimale delle cellule BLBC. La soppressione dell‟espressione dell‟annessina A1 mediante utilizzo di siRNA e shRNA ha generato un cambiamento del fenotipo cellulare: le cellule BLBC normali in cui ANXA1 si localizza in alcuni siti della membrana plasmatica ricchi in actina e in strutture di movimento hanno assunto, in assenza della proteina, un fenotipo più simile a quello di cellule mesenchimali dell‟epitelio, a basso indice di migrazione. La reversione del fenotipo è associata a un chiaro rimodellamento dell‟actina citoscheletrica; i ripiegamenti della membrana plasmatica ricchi in actina erano persi e si formavano lunghe stress fiber di F-actina. La soppressione dell‟espressione dell‟ANXA1 inoltre induce in tutte le cellule, la formazione di giunzioni cellula-cellula contenenti β- catenina chiaramente più visibili nelle cellule a fenotipo generalmente molto mobile. La regolazione negativa di annessina A1 riduce significativamente le distanze e la velocità di migrazione suggerendo per la proteina un coinvolgimento nel

cambiamento del fenotipo delle cellule BLBC e un‟induzione della migrazione in queste cellule in vitro (de Graauwa et al., 2010).

Nello stesso anno Côtè et al. (2010) hanno dimostrato che annessina A1 è un bersaglio del pathway delle chinasi p38/MAPKAP e che è in grado di regolare la migrazione delle cellule endoteliali in risposta al fattore di crescita VEGF. I dati ottenuti mostrano, infatti, che la fosforilazione di annessina A1 è indotta dal VEGF e inibita da p38, che l‟attivazione della chinasi LIM mediata da VEGF a valle del pathway di p38 induce la fosforilazione di annessina A1, che la migrazione cellulare e la formazione dei tubuli indotte da VEGF è inibita in cellule in cui l‟espressione di ANXA1 è abolita e che la migrazione cellulare mediata da VEGF/ANXA1 è compromessa quando p38 è inibito. Sulla base di questi risultati gli autori hanno concluso che la fosforilazione di annessina A1 regola l‟effetto angiogenico associato all‟attivazione dell‟asse p38/LIM-chinasi da parte del VEGF (Côtè et al., 2010)