Topi Knock Out per annessina A

È chiaro che la famiglia delle annessine è molto antica ma, a dispetto delle numerose evidenze sul ruolo di queste proteine nella fisiologia cellulare, la maggior parte degli studi di delezione genica hanno generato topi vitali. Un‟analisi più accurata dei fenotipi risultanti può fornire evidenze utili sul ruolo di alcuni membri della famiglia delle annessine. Ad esempio, i topi ANXA2-/- sono vitali ma mostrano una fibrinolisi e un‟angiogenesi anormali (Ling et al., 2004) se paragonati a controlli wild type, mentre i topi ANXA5-/- non solo sono vitali ma non mostrano alcun deficit metabolico o funzionale (Brachvogel et al., 2003). I topi ANXA6-/- sono vitali e non hanno anomalie cardiovascolari o del sistema immunitario (Hawkins et al., 1999), anche se la sovra- espressione di questo gene compromette l‟omeostasi del calcio nel cuore e genera alla fine insufficienza cardiaca (Gunteski-Hamblin et al., 1996). I dati a disposizione sull‟ANXA7 sono confusi, un gruppo di ricerca riporta che la delezione di questo gene è letale (Srivastava & Pollard, 2000) mentre gli animali eterozigoti sono vitali e mostrano alcune anomalie tra le quali ipertrofia della ghiandola renale (Srivastava et al., 2002a) ed espressione anormale del recettore per l‟IP-3 (Srivastava et al., 2002b).

Un altro gruppo di ricerca ha invece mostrato che i topi ANXA7 sono vitali, fertili e non mostrano un fenotipo particolare benché ci siano indicazioni di un alterato accoppiamento elettro-meccanico nei loro cardiomiociti (Herr et al., 2001).

È chiaro che la delezione del gene dell‟ANXA1 non è un evento letale. Inoltre molti dei parametri che sono stati esaminati come il numero di nascite e la riproduzione, le curve di crescita, l‟endocrinologia, le analisi istopatologiche e la necroscopia, non sembrano alterati, ad eccezione di quelli correlati alla risposta infiammatoria (Hannon et al., 2003; Yang et al., 2004). Le piccole differenze riscontrate tra i topi ANXA1-/- e ANXA1+/+ consistono in piccole alterazioni degli elettroliti plasmatici o nel peso degli organi interni e sono difficilmente ascrivibili a un particolare quadro clinico. Una delle ipotesi riguardo all‟assenza di un fenotipo particolare nei topi nulli per l‟ANXA1 potrebbe essere riconducibile a fenomeni di ridondanza tra i membri di questa famiglia proteica. Alcune evidenze a conferma di questa ipotesi, derivano da osservazioni fatte sugli effetti della delezione del gene ANXA1 sull‟espressione genica di altre annessine, in alcuni tessuti. Questi cambiamenti sembrano essere tessuto-specifici poiché l‟espressione della maggior parte delle annessine (così come nel caso di COX-2, cPLA2 e iNOS) aumenta nel polmone e nel timo di individui maschi laddove nel fegato e nelle ovaie, le principali regolazioni sembrano essere negative e l‟espressione delle altre annessine è ridotta seguendo l‟andamento della delezione genica di ANXA1. Nel rene, nello stomaco, nell‟intestino, nella milza e nella ghiandola pituitaria e surrenale, ci sono evidenze di cambiamenti indipendenti nell‟espressione di queste proteine. Dei tessuti esaminati, il cuore sembra quello meno influenzato dalla delezione del gene ANXA1 in termini di variazioni nell‟espressione delle altre annessine (Wells et al., 2004).

Nei topi nulli per ANXA1 è anche osservabile la sovra-espressione di alcuni enzimi pro-infiammatori come l‟iNOS, la COX-2 e la cPLA2 nel polmone e nel timo. Questi dati suggeriscono che la COX-2 inducibile e la cPLA2 potrebbero essere indirettamente influenzate dalla delezione del gene dell‟ANXA1, come mostrato in alcuni lavori (Vishwanath et al., 1993; Newman et al., 1997) e come confermato da

alcune osservazioni in vivo in topi ANXA1-/- (e per certi versi anche in topi ANXA1+/-) che sembrano più suscettibili all‟infiammazione.

Tutti i dati presenti in letteratura indicano comunque una complessa interconnessione tessuto-specifica tra l‟espressione relativa dei membri della famiglia delle annessine, benché siano necessari studi indipendenti sugli effetti della delezione di ANXA1 sull‟espressione di altri geni.

Di grande interesse è il profilo di espressione della proteina osservato nello sviluppo embrionale e le informazioni sulle sue funzioni che ne derivano. I topi ANXA1+/- sono stati esaminati in diverse occasioni, mediante l‟analisi dell‟espressione di Lac-Z poiché, in una condizione di eterozigosi, è presumibile che il profilo di espressione della proteina e la sua regolazione siano relativamente normali grazie all‟attività dell‟allele inalterato e che la colorazione con la β-galattosidasi possa riflettere uno scenario più fisiologico. In queste condizioni, l‟espressione più sorprendente di ANXA1 è stata riscontrata durante lo sviluppo embrionale e neonatale, nell‟occhio, nell‟osso e nella pelle (Fig. 4.7).

Figura 4.7L‟occhio (A, B; pannello a), la pelle (D, E; pannello a) e l‟osso (A, B, C; pannello b) sono i maggiori siti di espressione dell‟ANXA1 durante l‟embriogenesi (Wells et al., 2004).

Diverse annessine, sono state osservate nel tessuto osseo o proposte come proteine importanti nel processo di osteogenesi. Le linee cellulari di osteosarcoma ad esempio, esprimono ANXA1, A2, A4 e A6 e la distribuzione intracellulare di queste proteine è alterata da agenti che interferiscono con l‟omeostasi del calcio intracellulare (Mohiti et al., 1995). ANXA1, A2, A5 e A6 sono espresse anche da osteoblasti primari in coltura e l‟espressione dell‟ANXA1 in queste cellule è indotta dai glucocorticoidi. Le vescicole della matrice, situate nel punto in cui avviene l‟inizio della calcificazione della cartilagine, contengono ANXA2, A5 e A6 e si ritiene che esse siano importanti per l‟assorbimento del calcio (Kirsch et al., 2000) e siano regolate positivamente in seguito a stimolazione della mineralizzazione con acido retinoico in condrociti in coltura (Wang & Kirsch, 2002). È stato ipotizzato che si possano verificare difetti nel metabolismo annessinico durante la crescita dei condrociti in coltura provenienti da animali con discondroplasia tibiale (Nie et al., 1995). Nonostante sia il sito di maggiore espressione per il gene, non ci sono difetti ovvi

nello sviluppo dello scheletro in topi ANXA1-/- benché non siano stati analizzati in dettaglio tutti gli aspetti di questo processo in tali animali. C‟è un‟ampia letteratura sulla distribuzione dei membri della famiglia delle annessine nella pelle così come sull‟importante funzione di ANXA1 in questo tessuto. Il profilo di espressione della proteina cambia in funzione dello stato di crescita dei fibroblasti di prepuzio umani (Schlaepfer & Haigler, 1990). I glucocorticoidi inibiscono la produzione di eicosanoidi da parte di queste cellule in vitro mediante attivazione di un pathway che coinvolge ANXA1 (Errasfa et al., 1985). La proteina è molto espressa nel periderma di pelle embrionale umana (54 giorni). Questa espressione cambia nella pelle di neonato, dove i cheratinociti basali e quelli sovra-basali sono positivi per ANXA1 a differenza che nella pelle adulta dove solo le cellule basali esprimono la proteina (Serres et al., 1994a; Serres et al., 1994b). Anche i cheratinociti basali della ghiandola sudoripara esocrina mostrano grandi quantità di ANXA1 (Fava et al., 1993). Bastian et al. (1993) hanno osservato che ANXA1 (e ANXA2) è molto espressa nei dotti delle ghiandole sudoripare adulte umane così come nei cheratinociti di tessuto infiammato laddove ANXA3, A4, A5 e A6 non mostrano diversi profili di espressione. Nello stesso studio gli autori hanno dimostrato che l‟espressione dell‟ANXA1 aumenta nelle cellule differenziate di carcinoma squamoso ma non nelle cellule non differenziate. Diversi ricercatori hanno riportato cambiamenti nella disposizione intracellulare dell‟ANXA1 nella pelle umana prelevata da lesioni psoriatiche (Ikai et al., 1993) o da altre condizioni patologiche (Kitajima et al., 1991). È stato dimostrato che i cheratinociti stratificati contengono ANXA1 concatenata (Ma & Ozers, 1996). L‟ANXA1 è indotta nella pelle di ratto e la proteina intracellulare è esternalizzata verso la superficie cellulare in seguito a trattamento topico con desametasone-17-valerato (Ahluwalia et al., 1994). Questo farmaco è in grado di inibire anche l‟infiammazione neurogenica causata da stimolazione antidromica del nervo safeno ma questo fenomeno, è in parte abolito dall‟utilizzo di un anticorpo neutralizzante diretto contro ANXA1 (Ahluwalia et al., 1995). ANXA1 o il suo peptide mimetico bioattivo bloccano l‟infiltrazione dei neutrofili (Perretti & Flower, 1993) ma non quella degli eosinofili (Kerschbaum et al., 1997) nei modelli murini d‟infiammazione della pelle e d‟immunizzazione passiva del topo, e la somministrazione di un anticorpo neutralizzante ANXA1 esacerba enormemente l‟infiammazione cutanea causata dall‟iniezione di zimosano (Perretti et al., 1996). Benché non ci siano evidenze di un‟istologia alterata nella pelle di topi ANXA1-

/-, dati preliminari suggeriscono che questo tessuto è più sensibile a processi infiammatori causati da iniezione sottocutanea di zimosano (Wells et al., 2004).

Ci sono pochi lavori in letteratura che mostrano l‟espressione dell‟ANXA1 nell‟occhio. ANXA1 e A5 sono state osservate ad esempio nell‟occhio di molluschi come Aplysia californica e Helix pomatia, dove si crede che esse abbiano un ruolo nelle vie di segnalazione intracellulari (Kerschbaum et al., 1997). Nei mammiferi, vari membri della famiglia delle annessine, inclusi ANXA1 e A2, sono stati identificati in estratti proteici della lente di bovini (Kobayashi et al., 1990; Ohta A, Ohsaka et al., 1989) e come le principali proteine estrinseche della membrana delle fibre delle lenti (Takahashi et al., 1989). Blanquet et al. (1988) hanno osservato che il fattore di crescita FGF fosforila una delle annessina (probabilmente ANXA1) nelle cellule di epitelio della lente nel bovino e che questa fosforilazione sembra regolare l‟attività anti-fosfolipasica della proteina. Più recentemente, una proteina strettamente correlata, l‟ANXA2, è stata identificata nei tessuti della cornea di ratto mediante tecniche di RT-PCR e Western Blot: la proteina è localizzata nei cheratinociti e nelle cellule dell‟epitelio della cornea, dove migra sulla superficie cellulare in seguito a danno (Matsuda et al., 1999). È interessante notare che i peptidi anti-infiammatori

derivanti dall‟annessina A1, inibiscono le uveiti indotte da endotossine nei ratti, con una potenza pari a quella dei glucocorticoidi (Chan et al., 1991).

I dati presenti in letteratura riportano e confermano la presenza di una trascrizione attiva del gene ANXA1, importante principalmente nelle risposte immunitarie in molti tessuti inclusi la pelle, le vie respiratorie e altri tessuti coinvolti nella difesa dell‟organismo da attacchi microbiologici o nella riparazione tissutale.

A dispetto della potenziale importanza ascritta all‟ANXA1 è sorprendente che così poche anomalie siano identificabili nei topi nulli per la proteina. Questo fenomeno potrebbe essere dovuto a meccanismi compensatori di altri membri della famiglia delle annessine, come è stato suggerito per alcuni tessuti (Wells et al., 2004).

CAPITOLO 5

Annessina A1: il nuovo volto di una proteina antica