Contributo di altre cellule staminali al processo di riparazione muscolare Fino ad oggi le cellule satellite muscolari erano considerate essere la sola fonte d

mionuclei nella riparazione del muscolo scheletrico (Fig. 2.6). Recenti scoperte hanno invece dimostrato la presenza di cellule staminali multipotenti in vari tessuti adulti e modificato la visione molto diffusa che cellule staminali tessuto-specifiche siano pre- determinate a specifiche linee cellulari. Le cellule staminali adulte isolate da vari tessuti, infatti, sembrano differenziare in vitro in molteplici linee cellulari in base agli stimoli ambientali. Cellule progenitore isolate dal midollo osseo (BM) (Bittner et al., 1999; Ferrari et al., 1998; Gussoni et al., 1999; Labarge & Blau, 2002), dal muscolo adulto (Asakura et al., 2002; Gussoni et al., 1999; Jankowski et al., 2002; Qu- Petersen et al., 2002; Torrente et al., 2001), dal compartimento neuronale (Clarke et al., 2000; Galli et al., 2000) e da vari tessuti mesenchimali (Young et al., 2001a; Young et al., 2001b) possono tutte differenziare in cellule muscolari (Fig. 2.6).

In particolare, è stato dimostrato che le cellule del BM e le staminali adulte del muscolo, differenziano in cellule muscolari in vitro e contribuiscono alla rigenerazione muscolare in vivo (Goldring et al., 2002; Grounds et al., 2002; Seale & Rudnicki, 2000).

2.5.1 Cellule staminali residenti non muscolari

Una dimostrazione sorprendente che cellule staminali non-muscolari partecipano alla rigenerazione muscolare è stata presentata in alcuni lavori di Ferrari et al. (1998). In questo studio cellule del BM provenienti da topi esprimenti il gene batterico reporter LacZ a valle di un promotore muscolo-specifico (transgene ML3CFnLacZ), sono state trapiantate mediante somministrazione intramuscolare o endovenosa in topi con immunodeficienza severa scid/bg (topi in cui sono combinate caratteristiche di animali scid, con deficit funzionali delle cellule B e T, e caratteristiche di animali beige che hanno una bassa attività intrinseca delle cellule NK) (Ferrari et al., 1998; Krensky, 1997). Le cellule muscolari provenienti dal donatore (LacZ+) erano individuabili con certezza all‟interno della muscolatura del topo ricevente in entrambi i modelli di trapianto. La frequenza con cui questo evento avveniva era però molto bassa se comparata con l‟incorporazione dei mioblasti, e richiedeva l‟induzione di una rigenerazione muscolare estesa (Ferrari et al., 1998). In modo simile era stata osservata in altri studi, l‟incorporazione delle cellule del BM derivanti da un donatore in muscolo cardiaco e scheletrico di topi mdx (Bittner et al., 1999; Gussoni et al., 1999). Gussoni et al. (1999) hanno dimostrato che l‟attività miogenica può essere riscontrata in una popolazione arricchita di cellule staminali derivanti dal BM chiamata BM side population (BMSP) che contiene cellule staminali ematopoietiche. L‟isolamento di una popolazione altamente arricchita di cellule BMSP mediante selezione per fluorescenza (FACS sorting) è basata sulla capacità unica di queste cellule di escludere attivamente coloranti come l‟Hoechst 33342, capacità dovuta all‟alta espressione di geni mdr (multidrug resistant) (Goodell et al., 1996). Queste cellule SP del midollo osseo sono positive per Sca-1 (Stem cell antigen-1), cKit, CD43, CD45, a bassa espressione o negative per B220, Mac-1, Gr-1, CD4, CD5, CD8 e negative per CD34 (Gussoni et al., 1999). Quando somministrate per via endovenosa (iniezione nella vena della coda), le cellule SP del midollo osseo sono in grado di contribuire ai mionuclei delle miofibre e di ricostituire l‟espressione della distrofina per rigenerare il muscolo scheletrico di topi mdx, tuttavia i livelli di rigenerazione sono molto bassi poiché a 8-12 settimane dall‟iniezione solo l‟1-4% del totale delle miofibre esprime la distrofina e solo il 10-40% di questi miofibre contiene nuclei derivanti dalla fusione con cellule del donatore (Gussoni et al., 1999).

LaBarge & Blau (2002) hanno definitivamente dimostrato che le cellule derivanti dal midollo osseo non solo contribuiscono a rigenerare le miofibre ma sono anche in grado di ricostituire la popolazione di riserva delle cellule satellite. In questo studio i topi sono stati irradiati in tutto il corpo e le cellule derivanti dal midollo osseo GFP- positive del donatore sono state trapiantate mediante iniezione nella vena caudale. Tra i due e i sette mesi dopo il trapianto, sono state identificate cellule GFP-positive che esprimevano marcatori delle cellule satellite e si trovavano nella loro corretta posizione anatomica. La progenie delle cellule satellite GFP-positive isolate dal muscolo dei topi riceventi, esprimeva i marcatori delle cellule satellite e andava incontro a differenziamento muscolare quando esposta a mezzi di coltura a basso contenuto di siero in vitro e contribuiva alla formazione di nuove miofibre quando iniettata nel muscolo TA di topi riceventi scid.

Questi dati presi nel loro insieme dimostrano che in seguito a trapianto, le cellule di midollo osseo possono acquisire caratteristiche di cellule satellite muscolari. La

delezione mediante irradiazione localizzata della popolazione di cellule satellite muscolari potenzia, inoltre, l‟incorporazione delle cellule GFP-positive derivanti dal midollo osseo del donatore nel compartimento delle cellule satellite e in una condizione di danno muscolare indotto mediante esercizio fisico forzato, aumenta la frequenza con cui tali cellule contribuiscono alla formazione di nuove miofibre (LaBarge & Blau, 2002). In certe condizioni può essere aumentata la frequenza di conversione delle cellule del midollo osseo in cellule miogeniche. Queste osservazioni fatte in modelli murini ricapitolano ciò che accade nelle distrofie muscolari umane, come suggerito da uno studio su pazienti DMD che hanno ricevuto un trapianto di midollo osseo in età precoce (Gussoni et al., 2002). In questo caso i nuclei di fusione provenienti dal donatore sono stati identificati nella muscolatura del paziente e come nei modelli murini tali eventi di fusione non sembrano aumentare in modo significativo il numero di fibre distrofina-positive. Questi risultati evidenziano un‟incorporazione lenta e inefficiente delle cellule derivanti dal midollo osseo nella muscolatura se comparata con quella di mioblasti, rendendo questo tipo d‟intervento terapeutico inefficace (Ferrari et al., 1998; Heslop et al., 2001; Wernig et al., 2000). È chiaro che saranno necessari altri studi per stabilire le condizioni cellulari e ambientali ottimali per promuovere il reclutamento e la conversione delle cellule staminali non muscolari in cellule miogeniche a fini terapeutici e per analizzare il loro ruolo nei processi di riparazione muscolare.

2.5.2 Cellule staminali residenti muscolari

Similmente alle cellule derivanti dal midollo osseo, dai muscoli scheletrici può essere isolata una popolazione arricchita di cellule staminali adulte mediante analisi FACS sulla base dell‟esclusione del colorante Hoechst 33342 (Asakura et al., 2002; Gussoni et al., 1999). Questa popolazione di cellule staminali muscolari detta anche mSP, è capace di ricostituire l‟intero repertorio ematopoietico in seguito ad iniezione endovenosa in topi letalmente irradiati anche se in maniera meno efficace delle cellule SP del midollo osseo (Gussoni et al., 1999). Le mSP possono in seguito ad iniezione endovenosa, trasformarsi in vivo in cellule muscolari, come dimostrato dalla presenza di una percentuale di miofibre (3-9%) che esprimono distrofina di cui il 3-9% contiene nuclei derivanti dal donatore (Gussoni et al., 1999). La presenza di mSP nella muscolatura di topi Pax7-/- che mancano di cellule satellite, suggerisce che le mSP e le cellule satellite rappresentano distinte popolazioni cellulari (Seale et al., 2000). Questa ipotesi è sostenuta dall‟osservazione che le mSP non esprimono i marcatori delle cellule satellite Myf5-nLacZ, Pax7 o la desmina (Asakura et al., 2002). L‟aumentata propensione delle cellule mSP Pax7-positive a formare colonie ematopoietiche in vitro e la competenza delle mSP normali a dare origine a cellule satellite all‟interno di un muscolo ricevente, suggeriscono che tali cellule potrebbero rappresentare i progenitori delle cellule satellite (Asakura et al., 2002; Gussoni et al., 1999; Seale et al., 2000). La conversione in vitro delle mSP in cellule muscolari richiede metodi di co-coltura con mioblasti e ciò suggerisce che il processo è soggetto a una regolazione induttiva mediata da interazioni cellulari (Asakura et al., 2002). Ci sono chiare evidenze sull‟esistenza di progenitori cellulari con potenziale miogenico diversi dalle cellule satellite all‟interno del tessuto muscolare scheletrico. Benché le mSP rappresentino una popolazione cellulare separata da quella delle cellule satellite, esse potrebbero rappresentare i progenitori cellulari delle cellule satellite e/o di quelle muscolari capaci di eventi di fusione diretti (Fig. 2.5).

Il fenotipo delle SP proviene da un efficiente efflusso del colorante Hoechst e quindi fornisce una popolazione cellulare mista con poche informazioni sulle caratteristiche cellulari o sulla loro origine. Sta divenendo veramente importante

caratterizzare le cellule staminali derivanti dal muscolo sulla base dei marcatori della superficie cellulare. Quelli di particolare interesse sono stati in precedenza utilizzati per definire le SP murine del midollo osseo come Sca-1, CD34 e CD45. La maggior parte delle mSP (92%) esprime Sca-1 laddove solo il 16% esprime CD45. Le cellule CD45+ ma non quelle CD45- derivanti da muscolo di topo, sono responsabili della maggior parte dell‟attività ematopoietica in vitro ed in vivo (Asakura et al., 2002; McKinney-Freeman et al., 2002). Una frazione di cellule mSP CD45+ (9%) e CD45- (5%) subisce una conversione miogenica quando messa in co-coltura con i mioblasti in vitro (Asakura et al., 2002). Il potenziale miogenico in seguito ad iniezione intramuscolare, sembra maggiore nelle cellule derivanti dal muscolo CD45+ rispetto a quelle CD45- (McKinney-Freeman et al., 2002). La conversione miogenica delle cellule Sca-1+/CD45+, una popolazione generalmente associata a un potenziale di differenziamento ematopoietico, suggerisce che è possibile una reversione del destino cellulare o un trans-differenziamento, sebbene a livelli molto bassi. Un‟altra popolazione cellulare molto interessante, è quella delle cellule Sca-1+/CD45+ isolata dal muscolo di topo (Jankowski et al.,2002; Qu-Petersen et al., 2002; Torrente et al., 2001). CD34 è una glicoproteina trans-membrana che è espressa nei progenitori mieloidi e nelle cellule endoteliali (Fennie et al., 1995; Krause et al., 1994; Morel et al., 1996). È stato dimostrato che un sistema di coltura cellulare basato su serie successive di semina cellulare, combinato con la tecnica di selezione tramite FACS, facilita l‟arricchimento e la purificazione delle cellule Sca-1+/CD34+ in base al potenziale sia miogenico sia ematopoietico (Torrente et al., 2001). Quando iniettate nella circolazione arteriosa degli arti di topi mdx, l‟ultimo passaggio di adesione in piastra delle cellule Sca-1+/CD34+ è in grado di associarsi all‟endotelio (Torrente et al., 2001).

In eventi di rigenerazione muscolare che coinvolgono anche i vasi inoltre, le cellule Sca-1+/CD34+ migrano dai vasi sanguigni per essere incorporate nelle fibre in rigenerazione con una percentuale relativamente alta (12% delle fibre) (Torrente et al., 2001). Questi dati suggeriscono che le cellule staminali a doppia potenzialità presenti nei vasi sanguigni potrebbero attivarsi ed entrare nel programma miogenico quando il muscolo è sottoposto a danno molto esteso. I dati esistenti comunque non precludono la possibilità che le cellule derivanti dal muscolo Sca-1+/CD34+ rappresentino i progenitori delle cellule satellite. Un‟altra popolazione cellulare molto proliferativa è costituita dalle cellule Sca-1+/CD34+ (MDSC) ottenuta mediante il sistema di coltura a serie successive di semina, che aderisce tardivamente in piastra (late-adhering population), che sembra avere un potenziale miogenico ed un‟alta capacità rigenerativa in vivo (Qu-Petersen et al., 2002). Le cellule MDSC hanno le caratteristiche uniche generalmente associate ai precursori cellulari non determinati e cioè alta capacità di auto-rinnovo, alta capacità proliferativa e capacità multipotenti (Qu-Petersen et al., 2002). Le MDSC sono c-Kit-/CD45- negative e ciò esclude una loro eventuale origine di cellule ematopoietiche. Diverse osservazioni suggeriscono che esse sono progenitori delle cellule satellite. Innanzitutto le MDSC hanno un alto potenziale di conversione miogenica in vitro e in vivo. Secondo, esse possono esprimere spontaneamente i marcatori muscolari, MyoD e desmina. Infine, hanno caratteristiche fenotipiche simili (Sca-1+/M-caderina) a quelle di una sub-popolazione di cellule che sono state identificate in situ come cellule satellite (Qu-Petersen et al., 2002). Un altro studio in vivo conferma la pronunciata capacità rigenerativa della popolazione late-adhering CD34-positiva di cellule staminali derivanti da muscolo rispetto alla popolazione CD34-negativa (Jankowski et al., 2002). Sembra quindi che CD34 giochi un ruolo importante nell‟identificazione dei progenitori miogenici. L‟identificazione di una sub-popolazione di cellule satellite di topo CD34-positiva

suggerisce che l‟antigene è espresso anche nelle cellule muscolari e quindi evidenzia la necessità di marcatori multilpli per l‟identificazione delle cellule staminali derivanti dal muscolo diverse dalle cellule satellite (Beauchamp et al., 2000; Lee et al., 2000). I dati a oggi disponibili supportano l‟ipotesi che i progenitori derivanti dal muscolo, diversi dalle cellule satellite, sono capaci di differenziamento muscolare e d‟integrazione in vivo nel muscolo in rigenerazione. La comprensione dei pathway di segnalazione e molecolari coinvolti in questo processo di determinazione cellulare sta divenendo una questione estremamente importante nel campo della rigenerazione muscolare e della biologia cellulare. Saranno necessari altri studi per determinare se esistono molteplici tipi di cellule staminali derivanti dal muscolo e se essi mostrano diverse capacità di rigenerazione.

2.6 Contributo delle fibre in degenerazione alla formazione delle nuove miofibre