La via di segnalazione beta-adrenergica è in grado di regolare diversi processi cel- lulari che contribuiscono all’inizio e alla progressione del cancro, inclusi processi come l’infiammazione, l’angiogenesi, l’apoptosi, la motilità cellulare, la riparazione del DNA e la risposta immunitaria. Infatti, le influenze dei -AR si rispecchiano sulla progressione tumorale con diversi processi, come il reclutamento di macrofagi nel tumore primario, l’aumentata espressione di citochine pro-infiammatorie come IL-6 ed IL-8 da parte delle cellule tumorali ed immunitarie, l’aumento dell’angiogenesi mediata da VEGF, l’aumento dell’invasione tissutale mediata da MMP. Gli anta- gonisti di -AR da soli o in combinazione con i FANS ( agenti antinfiammatori non steroidei) sono risultati essere in grado di inibire la formazione di metastasi indotte da chirurgia nei modelli animali. Alcuni dati suggeriscono che il pathway di segnala- zione -AR è in grado di inibire la riparazione del DNA mediata da p53, sopprimere la citotossicità dei linfociti T e delle cellule naturali Killer. L’attivazione del SNS può regolare una vasta gamma di vie molecolari correlate al cancro attraverso la regola- zione diretta dei -AR presenti nelle cellule tumorali che nell’ambiente tumorali, come nei macrofagi e nelle cellule vascolari. Nei diversi modelli sperimentali di cancro, l’attivazione del sistema nervoso simpatico promuove la formazione di metastasi dai tumori epiteliali solidi e la disseminazione di tumori ematopoietici attraverso l’atti- vazione della PKA (protein kinase A) mediata dai beta-adrenorecettori. All’interno dell’ambiente tumorale, i recettori -adrenergici sulle cellule tumorali e stromali sono attivati dalle catecolamine provenienti dalle fibre nervose simpatiche locali (norepi- nefrina) e dal sangue circolante (epinefrina). I macrofagi associati al tumore sono il target chiave della regolazione beta-adrenergica in diversi contesti tumorali. La re- golazione del sistema nervoso simpatico ed il microambiente tumorale sono elementi correlati l’uno all’altro, che hanno evidenziato il collegamento tra stress e progres- sione tumorale, suggerendo nuovi target terapeutici. Gli studi epidemiologici hanno anche evidenziato come l’uso di beta-bloccanti possa ridurre la progressione di diver- si tumori, mentre l’uso di agonisti dei recettori -adrenergici accelera la progressione
e la formazione di metastasi anche in assenza di stress. La via di segnalazione beta- adrenergica media la risposta fight-or-flight indotta dal sistema nervoso simpatico; l’attivazione di quest’ultimo permette il rilascio delle catecolamine. La risposta allo stress acuto può incrementare di 10 volte in pochi secondi i livelli di norepinefrina ed epinefrina, i cui livelli basali sono comunque fluttuanti a seconda della risposta dell’organismo e delle condizioni ambientali. Oltre al controllo del sistema nervoso centrale sul SNS, quest’ultimo viene influenzato dai processi regolatori locali per la regolazione dell’attività, del rilascio e della degradazione delle catecolamine. Il risultato è che la concentrazione di norepinefrina ed epinefrina può differire in modo sostanziale nei diversi ambienti tissutali. Nell’ambiente tumorale si ha il rilascio di epinefrina e norepinefrina come risposta del SNS alle condizioni di stress. E’ interes- sante notare che i dati hanno evidenziato un aumento della densità dei collegamenti nervoso tra SNS e tessuto parenchimale in condizioni di stress cronico, implican- do che la regolazione dei -AR può avvenire anche dall’esterno del tumore oltre che dall’interno del tumore stesso. Ciò complicherebbe il targeting di interventi tera- peutici sui -AR del tumore, ma implica che l’uso di antagonisti dei -AR consente di sopprimere il supporto sistemico alla progressione del tumore.
Entrambe le catecolamine si legano ai recettori beta-adrenergici, portando all’atti- vazione mediata da Gs dell’adenilato ciclasi ed alla conversione di ATP in cAMP. Il flusso transienti di cAMP intracellulare permette di attivare due dei maggiori si- stemi effettori biochimici. Il cAMP attiva PKA, permettendo la fosforilazione di numerose proteine target, inclusi i fattori di trascrizione delle famiglie CREB/ATF e GATA, così come quelli di BARK (chinasi del recettore -adrenergico). PKA regola una varietà di processi cellulari, che vanno dal metabolismo alla crescita cellulare, alla differenziazione, alla morfologia, alla motilità ed alla trascrizione genica. L’e- spressione genica viene regolata tramite l’attivazione della famiglia CREB/ATF, che impegna circa il 20% dei geni umani. Le alterazioni trascrizionali indotte da PKA, spesso, promuovono il differenziamento cellulare a scapito della proliferazione e coordinano le risposte, a livello di trascrittoma, allo stress o alle perturbazioni omeostatiche. BARK permette il reclutamento della -arrestina, la quale desensibi- lizza transitoriamente il sistema di segnalazione dei recettori -adrenergici ed attiva il pathway MAPK/SRC/RAS e la chinasi Srk, portando all’attivazione di fattori di trascrizione come STAT3 e chinasi a valle, come FAK (chinasi di adesione focale). L’attivazione di FAK permette la modulazione della motilità cellulare attraverso la dinamica del citoscheletro, nonché la resistenza cellulare all’apoptosi. L’attivazione dipendente da PKA di BAD, della famiglia Bcl-2, può rendere la cellula tumorale resistente all’apoptosi indotta da chemioterapici. Nel secondo maggiore pathway di effettori, l’attivazione da parte di cAMP di EPAC (proteina di scambio attivata da adenilato ciclasi) porta all’attivazione di Rap1A, che a sua volta stimola effettori a valle come B-Raf, MAP/ERK 1/2. Oltre gli effetti del pathway MAPK sulla crescita e proliferazione cellulare, la via di segnalazione EPAC attiva degli effettori a valle su diversi processi cellulari, inclusi la trascrizione genica mediata dalla famiglia di fattori di trascrizione AP-1 ed Ets. Lo schema generale delle risposte trascrizionali
indotta dalla via di segnalazione -adrenergico comprende l’espressione up-regolata di geni associati alla formazione di metastasi, coinvolti nell’infiammazione, nell’an- giogenesi, nell’invasione tissutale e nella transizione mesenchimale-epiteliale, invece viene down-regolata l’espressione di geni che facilitano la risposta immunitaria anti- tumorale. Oltre agli effetti diretti sui recettori beta da parte delle cellule tumorali, l’attivazione del SNS modula la biologia del tumore tramite la regolazione della generazione e del reclutamento di monociti e macrofagi, così come della crescita e della differenziazione delle cellule endoteliali vascolari e dei periciti. Gli effetti beta-adrenergici sulle cellule stromali nel microambiente tumorale, generalmente, sinergizzano con gli effetti diretti sulle cellule tumorali per la promozione della so- pravvivenza, della crescita e della formazione di metastasi del cancro. L’influenza dei recettori beta-adrenergici sull’infiammazione, l’angiogenesi e l’invasione sembra essere mediata principalmente dall’induzione di geni, codificanti le citochine ed i fattori di crescita, da parte di PKA, mentre EPAC induce effetti complementari ma distinti sulla morfologia e motilità cellulare [67]. Comprendere i pathway di rego- lazione coinvolti nello sviluppo e nella progressione del melanoma è essenziale per determinare i futuri target delle terapie.
Nel melanoma alcuni dei maggiori pathway di segnalazione risultano deregolati, co- me Ras, B-Raf, MEK, PTEN, PI3K e Akt. La scoperta nel 2002 che B-Raf è mutato in una larga percentuale di melanoma, ha portato a numerosi studi sulla via di segnalazione MAPK nel melanoma. I dati raccolti hanno mostrato che l’at- tivazione costitutiva della cascata di segnalazione Ras-Raf-MEK-ERK è un segno distintivo del melanoma maligno cutaneo. Le alterazione delle proteine coinvolte in questo pathway sono già note, infatti Ras è mutato in circa il 15-20% dei mela- nomi umani. Le proteine Ras regolano la proliferazione cellulare, la sopravvivenza e la differenziazione attivando un gran numero di proteine effettrici, tra cui PI3K e le tre protein chinasi Raf (A-Raf, B-Raf and C-Raf). B-Raf è risultato muta- to fino nell’82% dei nevi melanociti cutanei, nel 66% dei melanomi primari e nel 40-68% dei melanomi metastatici; più dell’80% delle varianti alleliche oncogene di B-Raf presentano la mutazione V599E (da valina ad acido glutammico) che ne causa un’attivazione costitutiva. L’attivazione di B-Raf, da parte di N-Ras, porta all’atti- vazione di ERK; di notevole interesse è la scoperta che le mutazioni B-Raf e N-Ras sono mutuamente esclusive e ciò coincide con la scoperta che ERK attiva è stata rilevata nelle fasi tardive del melanoma sia nelle linee cellulari che nei tessuti tu- morali. L’attivazione costitutiva della cascata di segnalazione Ras-Raf-MEK-ERK contribuisce alla tumorigenesi del melanoma aumentando la proliferazione cellulare, l’invasione tumorale e la metastasi, mentre contemporaneamente inibisce l’apoptosi. L’importanza dell’attivazione costitutiva di questo pathway per il mantenimento del fenotipo del melanoma è stata dimostrata mediante l’inibizione mirata dei pathway B-Raf e MEK (MAPK chinasi che nella via di segnalazione delle MAPK è a valle di B-Raf) che ha portato ad una significativa inibizione della crescita del melanoma. Le mutazioni di B-Raf e di N-Ras sono importanti per la formazione ed il manteni- mento della maggior parte dei melanomi, ma sono necessarie ulteriori mutazioni o
modificazioni per supportare la progressione del melanoma ed il suo passaggio a tipo invasivo. La proteina ERK attivata gioca un ruolo fondamentale nella proliferazione cellulare controllando la transizione dalla fase G1 alla fase S, tramite la regolazione negativa dell’inibitore p27/Kip1 e l’up-regolazione dell’attività c-Myc. L’inibizione dell’attività di ERK è associata ad una proliferazione ridotta. Inoltre, la regolazione di p27/Kip1 è determinata anche da B-Raf e Skp2 ciclina D1- dipendente. Un altro target importante di ERK è il fattore di trascrizione del dominio Brn-2 POU, il quale è altamente espresso nelle linee cellulari di melanoma, ma non nei melanoci- ti. L’espressione di Brn-2 è regolato positivamente anche da B-Raf e dalla via di segnalazione MAPK. L’over-espressione di Brn-2 è associata ad un aumento della proliferazione, mentre la sua delezione, in cellule di melanoma esprimenti B-Raf in modo costitutivo, porta ad una diminuzione della proliferazione. Un altro mecca- nismo attraverso il quale ERK stimola la proliferazione, è attraverso la regolazione di c-Jun, di cui ne aumenta sia la trascrizione che la stabilità mediante l’interven- to, rispettivamente, di CREB e GSK3. La via costitutivamente attivata di ERK media la sopravvivenza specifica del melanoma, tramite l’inattivazione della pro- teina pro-apoptotica Bad e l’inibizione del pathway JAK-STAT. ERK contribuisce all’invasione tumorale e alla formazione delle metastasi andando a regolare l’espres- sione di proteine, come MMP e le integrine. Nel processo di metastasi è essenziale la degradazione della matrice extra-cellulare, per consentire lo stravaso e la migra- zione delle cellule metastatiche. Se si blocca l’attività di MEK-ERK si inibisce la proliferazione delle cellule di melanoma e si abroga la degradazione del collagene, di- minuendo il loro potenziale metastatico. E’ stato dimostrato che l’attivazione della via di segnalazione Raf-MEK-ERK controlla specificatamente l’espressione delle in- tegrine ed i cambiamenti delle adesioni cellulari durante il processo di trasformazione onco-genica.
Il pathway PI3K/Akt è attivato in diverse tipologie di cancro, principalmente a cau- sa della mutazione del gene soppressore del tumore PTEN. Nel melanoma, la perdita del Chr. 10 è stata riportata da Parmiter e collaboratori. Il gene PTEN codifica per una fosfatasi la cui funzione primaria è quella di degradare i prodotti della PI3K, defosforilando il Fosfatidilinositolo 1,4,5-trifosfato (PIP3) ed il Fosfatidilinositolo 4,5-bifosfato (PIP2). La perdita di PTEN funzionale, nelle cellule tumorali, provoca l’accumulo di questi messaggeri secondari, che a loro volta aumentano la fosforila- zione di Akt e la sua attività, con una consequenziale riduzione dell’apoptosi e/o un aumento del segnale mitogenico. Nelle linee cellulari di melanoma si ha un tasso di mutazione di PTEN del 30-50% ed i livelli di questa proteina sono alterati anche in assenza della mutazione genetica; per tali motivi oltre alla mutazione di PTEN sono necessari altri meccanismi, come il silenziamento epigenetico, o alterazioni di localizzazione subcellulare o di ubiquitinazione per causare l’inattivazione di PTEN. Il ruolo di PTEN nei melanomi è stato confermato da diversi studi funzionali, che hanno mostrato come PTEN e PI3K svolgano un ruolo importante nella tumorige- nesi del melanoma, infatti l’espressione ectopica di PTEN è in grado di sopprimere la crescita del melanoma e l’inibizione di PI3K porta ad un’attività antitumorale.
La perdita di attività di PTEN causa un aumento dell’attività di Akt. Akt/PKB (protein chinasi B) è una chinasi serina/treonina, attivata tramite fosforilazione, ed è fondamentale nella via di segnalazione PI3K. Diversi studi hanno dimostrato che Akt/PKB attiva la trascrizione di una vasta gamma di geni, in particolare quelli coinvolti nell’attivazione immunitaria, nella proliferazione cellulare, nell’apoptosi e nella sopravvivenza cellulare. L’aumentata espressione di pAkt è inversamente cor- relata con la sopravvivenza al melanoma ed è un fattore prognostico per i pazienti con melanomi dallo spessore minore di 1,5 mm. Un meccanismo alternativo dell’at- tivazione del pathway PI3K/Akt è l’attivazione di Akt stessa, che avviene quando si ha un numero aumentato di copie del gene Akt ed una diminuzione dell’attività di PTEN a seguito della perdita del gene. L’effetto positivo del pathway PI3K/Akt sul melanoma avviene tramite diversi meccanismi, tra cui l’inibizione dell’apoptosi, l’aumento della sopravvivenza cellulare e la regolazione del ciclo cellulare. Recen- temente, nello studio di Gomez-Gutierrez è stato dimostrato come un mutante di FKHRL1, la cui caratteristica è la mancanza di un sito di fosforilazione per Akt, induca l’apoptosi nelle cellule di melanoma. La proteina Akt attiva è in grado di potenziare gli effetti della proteina MELCAM sull’adesione cellulare, ma anche di indurre l’espressione di MMP-2 e MMP-9 tramite un meccanismo che coinvolge Akt nell’attivazione del fattore nucleare-Kappa B (NF-kB) e del suo legame al promoto- re di MMP. La sovra-espressione della forma attiva di Akt causa un’upregolazione di VEGF, un aumento del superossido ROS ed il passaggio ad un metabolismo più marcatamente glicolitico. PI3K/Akt contribuisce alla tumorigenesi regolando positivamente la ciclina D3 che contribuisce alla progressione G1-S. I meccanismi associati alla capacità di Akt di sopprimere l’apoptosi, includono la fosforilazione e l’inattivazione di proteine pro-apoptotiche come Bad e la caspasi-9. Gli effet- ti a valle dell’attivazione di Akt sono mediati attraverso l’inattivazione dei fattori di trascrizione denominati forkhead (FOX) e l’attivazione di NF-kB. In generale, nel melanoma si ha il pathway PI3K che risulta deregolato in concomitanza con l’attivazione costitutiva della via di segnalazione MAPK.
Le Wnt sono glicoproteine secrete che agiscono come ligandi per la stimolazione della trasduzione del segnale mediata da recettori coinvolti nella proliferazione cel- lulare e la sopravvivenza. Le proteine Wnt attivano almeno tre diversi percorsi: la segnalazione intracellulare Wnt / -catenina, Wnt/Ca2+ e il percorso di polarità planare/Wnt. Il primo percorso è definito canonico e comporta la stabilizzazione della -catenina, mentre gli altri due coinvolgono, rispettivamente, l’attivazione della PKC (Protein Kinase C) e di JNK (c-Jun N-terminal Kinase). L’attivazione di Wnt, tramite diversi passaggi, permette di bloccare la degradazione della -catenina, a ciò segue la traslocazione nucleare di quest’ultima che va ad agire con specifici fattori di trascrizione (TCF/LEF) per la regolazione di geni bersaglio. Un ruolo chiave nella via di segnalazione Wnt nello sviluppo dei melanociti è dato da MITF ( fattore di trascrizione della microftalmia), il quale è un effettore a valle della -catenina ed è essenziale per la proliferazione, la sopravvivenza ed il blocco dell’apoptosi. L’attiva- zione onco-genica della -catenina è stata dimostrata nel 23% delle linee cellulari di
melanoma e nelle metastasi, a conferma dell’ipotesi che il pathway Wnt contribuisce al benessere del melanoma. L’attivazione delle vie non canoniche di Wnt coinvol- ge CAMKII, PKC, PLC e PDE, ed è dovuta da Wnt4, Wnt11 e sopratutto Wnt5.
La proteina Wnt5 è up-regolata nel tumore al polmone, al seno ed alla prostata,
mentre è down-regolata nel tumore pancreatico; inoltre, è stato identificato come un marker per i tumori altamente aggressivi. L’espressione di questa proteina, a differenze delle altre di questa famiglia, non ha effetti importanti sulla stabilità del- la -catenina. Invece, essa stimola il rilascio intracellulare di Ca2+ e l’attivazione di
CAMKII e PKC in modo dipendente dalla proteina G. L’aumento dell’espressione di Wnt5 porta ad un’aumentata attività di PKC. L’espressione della proteina Wnt5
nelle biopsie di melanoma umane correla in modo diretto con l’aumento del grado tumorale, della motilità ed invasività delle metastasi di melanoma. L’inibizione di questo pathway tramite desensibilizzazione del recettore di Wnt5, Frizzled, porta ad
una diminuzione dell’attivazione del pathway PKC ed un’inibizione della motilità delle cellule di melanoma in vitro.
Le proteine JNK sono delle chinasi che intervengono nella regolazione della fisiologia dei mammiferi. L’attivazione di JNK è indotta da una varietà di stimoli extracellula- ri, come i fattori di crescita, le citochine, le radiazioni UV e gli ormoni. Un possibile meccanismo che spiega l’attivazione di JNK coinvolge la proteina p16, il cui gene risulta frequentemente deleto nel melanoma. E’ stato dimostrato che p16 può legare il loop ricco di glicina nel dominio N-terminale di JNK, inibendo la fosforilazione di c-Jun ed interferendo con la trasformazione cellulare promossa dal pathway di segnalazione Ras-JNK-c-Jun-AP-1. JNK è attivato dalla fosforilazione sequenziale da parte delle MAP chinasi. Il ruolo di JNK nel tumore dipende dal contesto geni- co, infatti può promuovere o eradicare i tumori. Tra le proteine fosforilate da JNK, quella che ha suscitato maggior interesse è c-Jun. La fosforilazione di quest’ultima proteina, componente del complesso di trascrizione AP-1, aumenta la sua capacità di attivare la trascrizione in risposta agli stimoli extracellulari. L’attivazione di JNK porta all’induzione dei geni bersaglio dipendenti da AP-1 ed implicati nella prolife- razione cellulare, nella morte cellulare e nel processo di infiammazione. I membri del complesso trascrizionale AP-1 comprendono c-Jun, JunB, JunD, c-Fos, FosB, Fra-1 e Fra-2, ognuno dei quali contiene una cerniera di leucina e si formano sia omodi- meri che eterodimeri attraverso questo dominio. Le diverse combinazioni di dimeri riconoscono elementi di risposta diversi nei promotori. I geni target di AP-1 sono regolati in modo differente dai diversi dimeri di AP-1. I cambiamenti dinamici nella composizione di AP-1 dopo gli stimoli legati allo stress determinano se le cellule vanno incontro ad apoptosi, alla sopravvivenza o alla senescenza. Sebbene il ruolo di JNK nell’oncogenesi è di recente scoperta, il ruolo di c-Jun è già affermato nei tumori aggressivi. Il pathway JNK/c-Jun contribuisce alla trasformazione cellulare, andando a down-regolare la proteina soppressore del tumore p53. ATF-2 è attivato tramite fosforilazione, nel melanoma, da JNK e p38 ed è un fattore di trascrizione che è implicato nella regolazione di TNF-, TGF- ed IL-6. ATF2 è implicata nello sviluppo e nella progressione tumorale.
La famiglia Nf-kB nei mammiferi contiene cinque membri: NF-kB1, NF-kB2, p65,RelB e cRel. Nf-kB sono spesso attivati nei tumori, inclusi i melanoma. Sono stati ri- portati diversi meccanismi che spiegano gli elevati livelli di attività di NF-kB nei melanomi maligni, ma i dati sembrano evidenziare che l’attivazione sia dovuta alla cooperazione di diversi fattori. Inoltre, sembra che ERK sia in grado di regolare l’attività di legame al DNA di NF-kB e che l’attivazione di questo fattore da parte di TNF- permetta di prevenire l’induzione all’apoptosi seguendo l’inibizione della via di segnalazione B-Raf. Il maggior contribuito dato da NF-kB allo sviluppo e alla progressione del melanoma è legato alla sua funzione di regolatore della sopravviven- za e dell’apoptosi. Inoltre, questo fattore di trascrizione provoca un’upregolazione della trascrizione di MMP2 e MMP9.
Le proteine STAT sono una famiglia di fattori di trascrizione coinvolti nell’attivazio- ne dei geni target in risposta alle citochine ed ai fattori di crescita. SI è ipotizzato che ci sono due meccanismi con cui le proteine STAT hanno un effetto sulla car- cinogenesi: il loro impatto sul sistema immunitario e la capacità di controllare i fattori di crescita, dell’apoptosi e dell’angiogenesi. E’ stato dimostrato che STAT3 svolge un ruolo importante nello sviluppo del melanoma, infatti l’espressione di una variante dominante negativa di STAT3 provoca la morte delle cellule di melanoma B16 e l’inibizione della proliferazione nel tessuto tumorale. La proteina STAT3 me- dia l’inibizione della crescita indotta da IL-6 nei melanociti e nei primi stati del melanoma, e promuove la crescita nei melanomi in stadi avanzati. Questa protei-