Il Western blotting è stato svolto seguendo le procedure classiche di preparazione, creando un gel di poliacrilammide, effettuando un elettroforesi dei campioni a cui, infine, hanno fatto seguito il trasferimento delle proteine su membrana ed il loro rile- vamento per mezzo di anticorpi. Sono stati usati i seguenti anticorpi : policlonali di coniglio anti-3-ARs (1:100), anti-Bax (1:100), anti-Bcl-2 (1:100), anti-VEGF (1:100), anti-Akt (1:1000), anti-pAkt (1:1000), anti-STAT3 (1:100), anti-iNOS (1:100), anti- AQP1 (1:300), anti-FGF-2 (1:200), anti-IGF-1 (1:100) and anti-Epo (1:100); poli- clonali di capra anti-Ki67 (1:200) e anti-Ang-2 (1:100); monoclonali di topo anti- citocromo-c (1:500), anti-pSTAT3 (1:100), anti-Fattore VIII (1:500) e anti--actina (1:2500).
Le immagini sono state acquisite tramite lo strumento Chemidoc XRS+ (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). La densità ottica delle bande è stata valutata tramite il software Image Lab 3.0 (Bio-Rad Laboratories).
I tessuti congelati sono stati omogenizzati in 10 mM Tris-HCL (pH 7.6), contenente 5 mM EGTA, 250 mM saccarosio e cocktail di inibitori delle proteasi e delle fosfa- tasi, e centrifugati a 22000g per 30 min a 4řC. Il surnatante contenente le proteine citosoliche è stato utilizzato per il rilevamento di Ki67, Bax, Bcl-2, citocromo c, Akt, pAkt, STAT3, pSTAT3, iNOS, VEGF, Factor VIII, FGF-2, IGF-1, Ang-2 o Epo. Il pellet è stato risospeso in 20 mM HEPES (pH 7.4), contenente 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 3 mM EGTA, 4 mg/ml n-dodecyl--maltoside e cocktail di inibitori delle proteasi e delle fosfatasi, e centrifugato a 22000g per 30 min a 4řC. Il surnatante è stato utilizzato per il rilevamento di 3-AR o aquaporin 1 (AQP1). Tutti gli anticorpi
primari e secondari sono di Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA), ad eccezione dell’anticorpo primario verso il citocromo c, proveniente da BD Bioscien- ces (San Diego, CA, USA), di quelli verso Akt e pAkt, provenienti da Cell Signaling (Danvers, MA, USA), dell’anticorpo primario verso il Fattore VIII, proveniente da Millipore (Billerica, MA, USA), ed infine dell’anticorpo primario verso la -actina e dell’anticorpo secondario di coniglio anti-topo legante HRP (horseradish peroxida- se) che provengono da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO,USA). La concentrazione delle proteine è stata quantificata tramite il fluorimetro (Qubit, Invitrogen). Aliquote di ogni campione contenenti uguali quantità di proteine (40 g) sono state sottoposte all’elettroforesi su gel di poliacrilammide in presenza di sodio dodecilsolfato (SDS- PAGE). La -actina è stata usata come controllo del caricamento. I gel sono stati trasferiti su una membrana di Poliviniliden difluoruro, ed i blot sono stati bloccati in latte scremato al 5% per 1 h a temperatura ambiente. I blot sono stati incubati per una notte a 4řC con gli anticorpi primari. Infine, i blot sono stati incubati per 1 h a temperatura ambiente con gli anticorpi secondari leganti HRP di topo anti-coniglio (1:5000), di topo anti-capra (1:5000) o di coniglio anti-topo (1:25000), per poi essere sviluppati con acqua ossigenata/luminolo. I dati sono stati normalizzati ai livelli di -actina. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in duplicato. Dopo le analisi statistiche, i risultati dei diversi esperimenti sono stati inclusi nel medesimo grafico. La preparazione del gel di poliacrilammide è divisa in due step: la preparazione del resolving gel e quella dello stacking gel. Lo stacking gel è un gel a maglie più strette, che serve per la preparazione dei pozzetti in cui vengono caricati i campioni di proteine ed ha il ruolo di compattare i campioni stessi in modo tale da permettere un’elettroforesi uniforme e una maggiore risoluzione. Il resolving gel è il gel di corsa che permette di ottenere la separazione delle proteine, che possono essere così com- parate in base al peso molecolare. Il resolving gel è preparato a diverse percentuali a seconda del peso molecolare della proteina che si vuole analizzare, ma tutte le ricette utilizzate per le diverse preparazioni si basano su quella del gel al 10%. La preparazione del resolving gel al 10% prevede i seguenti ingredienti: H2O dd 2,665
ml, Acrilammide/Bisacrilammide 40% 2,2 ml, Tris HCl pH 8.8 1,665 ml, SDS (so- diododecilsolfato) 10% 66,665 l, APS (ammonio persolfato) 10% 66,665 l, TEMED 7 l. L’APS ed il TEMED sono due catalizzatori della reazione di polimerizzazione di Acrilammide/Bisacrilammide che vengono aggiunti poco prima del caricamento del gel nei supporti. Al termine della polimerizzazione vengono aggiunti circa 2 ml di stacking gel, il quale è costituito dai medesimi reagenti del resolving, ma con con- centrazioni differenti: H2O dd 1,83 ml, Acrilammide/Bisacrilammide 40% 400 l, Tris
HCl pH 6.8 330 l, SDS (sodiododecilsolfato) 10% 26,665 l, APS (ammoniopersolfato) 10% 26,665 l, TEMED 7 l. I gel ad alta percentuale di poliacrilammide permettono di ottenere un’ottima risoluzione delle proteine a basso peso molecolare, mentre i gel con una bassa percentuale consentono un’ottima risoluzione delle proteine ad alto peso molecolare. Per ottenere la risoluzione di proteine con dimensioni comprese tra i 200KDa e i 70KDa vengono utilizzati gel con percentuali di poliacrilammide tra il 6-8%, per proteine da 80KDa a 50KDa gel all’8-10% ed infine per quelle da
45KDa-20KDa dei gel da 15-20%. Nel nostro esperimento le percentuali utilizzate per i gel sono state: 10% per i -AR, Epo, iNOS, Ang2, Fattore VIII e Ki-67 al 12% per pSTAT3/STAT3, Akt, pAkt Bax e Bcl-2, gel al 15% per VEGF, citocromo-c, AQP1, FGF-2 ed IGF-1 e -actina.
In alcuni casi sono stati utilizzati gel preconfezionati CriterionTM TGX Any kD Stain-FreeTM Precast Gel (Bio-Rad) a 18 pozzetti con ampio spettro di pesi mo- lecolari. Una volta che i gel sono polimerizzati e pronti all’uso vengono messi nel supporto dell’apparecchio per l’elettroforesi e viene versato il Running Buffer. La quantità per il caricamento dei campioni viene calcolata in modo tale da ottenere 40 g di proteine in ogni campione + i l di Sample Buffer, quest’ultimo ha il ruolo di preparare il campione e di visualizzare l’andamento della corsa elettroforetica. La composizione del Sample Buffer 5x per 50ml è: 7.5ml di glicerolo, 7.5ml di Tris 0.5M HCl a pH 6.8, 10ml di SDS al 10%, H2O distillata per arrivare a volume e 5-10 mg di
blu di bromofenolo; a questa ricetta si aggiunge -mercaptoetanolo 1:20 per avere il Sample Buffer completo. Il ruolo del glicerolo è svolto dalla sua caratteristica elevata densità che permette di spostare verso il fondo del pozzetto il campione proteico, il blu di bromofenolo è un colorante che permette di visualizzare tramite un fronte, di coloro blu appunto, la corsa elettroforetica, ed infine l’SDS ha il ruolo di denaturare le proteine, mentre il -mercaptoetanolo essendo un agente riducente rompe i ponti disolfuro presenti nelle proteine. Il Sample Buffer viene sempre aggiunto in modo tale da essere un volume pari ad 1/5 del volume totale (l proteine + l di Sample Buf- fer) ed il valore viene calcolato in base a quello del campione più diluito. I campioni con l’aggiunta di Sample Buffer vengono riscaldati a 95řC per 5 min, in modo tale da denaturare le proteine, ed infine caricati, insieme al marker, nei gel precedente- mente preparati. Nella vaschetta dell’apparecchio per l’elettroforesi viene aggiunto fino a volume il Running Buffer (per 1 litro: 100ml Tris Glicina 10x, 10ml SDS 10%, H2O dd fino a volume), il quale è un tampone di corsa che permette di veicolare il passaggio di corrente che parte dagli elettrodi permettendo così il movimento delle proteine dal polo negativo al polo positivo con una velocità di migrazione che risulta essere inversamente proporzionale al logaritmo del peso molecolare e direttamente proporzionale al voltaggio applicato (nel nostro caso 200V).
Al termine della corsa elettroforetica, si passa al trasferimento delle proteine dal gel alla membrana di poliviniliden difluoruro. In laboratorio è stato utilizzato il macchinario Trans-Blot Turbo (Bio-Rad). Con l’utilizzo di questo macchinario laR
procedura di trasferimento è risultata essere estremamente veloce, infatti è necessario posizionare il gel su una membrana già attivata, facendo attenzione all’assenza di bolle tra membrana e gel, ed effettuare la corsa nella macchina di trasferimento della durata di soli 7 minuti. Il controllo del trasferimento avviene grazie al marker colorato che ci consente tale verifica in modo immediato.
La membrana, prima di essere incubata con gli anticorpi, subisce un processo che permette di saturare su tutta la superficie i siti di legame che non hanno preceden- temente legato le proteine dei campioni, e ciò viene effettuato con una soluzione di bloccaggio. La soluzione di bloccaggio è una soluzione contenente latte al 3 o al
5% in TBST (tampone Tris contenente Tween 20); più è alta la percentuale di latte minore sarà il numero di legami aspecifici ma un’alta concentrazione può causare la presenza di macchie per cui sono necessarie diverse prove per determinare la percen- tuale da utilizzare per i diversi anticorpi. Per pSTAT3/STAT3, Bcl-2, Bax, -actina, -AR, Ki-67, FGF-2, IGF-1, Ang-2 ed Epo è stato usato latte al 3%; per VEGF, Fattore VIII, iNOS, citocromo-c e pAkt/Akt al 5%.
Il tempo di bloccaggio è 1h a temperatura ambiente, al termine vengono effettua- ti tre lavaggi in agitazione con TBST allo 0,1% per 7-8 min caduno. Al termine dei lavaggi, le membrane vengono immerse overnight ad una temperatura di 4řC nella soluzione contenente gli anticorpi primari diluiti nella soluzione di bloccaggio. La diluizione dell’anticorpo è molto variabile e per tale motivo è stato necessario effettuare diverse prove fino al raggiungimento di quella ottimale. Il procedimento continua con la rimozione della soluzione contenente l’anticorpo primario e tre lavag- gi in TBST allo 0,1% per 7-8 min caduno in agitazione. A questo punto si procede con la preparazione della soluzione in cui è presente l’anticorpo secondario in cui la membrana sarà incubata, in agitazione a temperatura ambiente, per 1h. Gli anti- corpi secondari sono specifici per il frammento cristallizzabile (Fc) dell’Ig primaria; sono coniugati con perossidasi di rafano, enzima che reagisce con H2O2 e che, in presenza di luminolo, produce luminescenza rilevabile da un apposito strumento. Gli anticorpi secondari utilizzati sono un mouse anti-rabbit della Santa Cruz (diluizione 1:5000) e un rabbit anti-mouse della Sigma-Aldrich (diluizione 1:25000).di nuovo, occhio agli Ab II da citare in base agli Ab I usati Una volta terminata l’incubazione si eseguono due lavaggi con TBST allo 0,1% ciascuno di 7-8 minuti ed infine si pone la membrana in una vaschetta con TBS, per poterla portare a sviluppare. Si procede ponendo la membrana per pochi minuti a contatto con una soluzione costituita da luminolo e H2O2 in rapporto 1:1, in modo tale da poter visualizzare la luminescenza
delle bande al transilluminatore. In laboratorio è stato utilizzato il transillumina- tore Chemi DocTM XRS+ System della Bio-Rad ed il software Image LabTM per acquisire le immagini. Una volta terminata l’acquisizione delle immagini si con- trolla il caricamento tramite l’analisi densitometrica utilizzando come riferimento una proteina costitutivamente sintetizzata che non subisce modifiche di espressione in seguito ai trattamenti svolti per le analisi, nel nostro caso è stata utilizzata la -actina. Tale controllo può essere effettuato aggiungendo l’anticorpo primario anti -actina dopo aver effettuato la procedura di stripping, utilizzando lo stripping buffer (50 ml di soluzione: 6.25 ml Tris pH 6.8, 1g SDS, 349 l di -mercaptoetanolo e acqua distillata a volume) che consente la rimozione degli anticorpi legati alla membrana. La soluzione prima di essere utilizzata viene portata a 50-60řC per 10-15 min ed i tempi di esposizione della membrana al buffer di stripping sono stati determinati per ogni anticorpo con diverse prove sperimentali. Dopo tale passaggio si rieffet- tua la procedura di blotting utilizzando gli anticorpi primari contro la proteina di riferimento.
Una volta ottenute le immagini delle proteine si effettua l’analisi densitometrica con il programma Image LabTM che permette di calcolare la densità relativa delle
bande rispetto ad una utilizzata come standard basandosi sull’intensità della banda stessa. Prima si calcolano separatamente le densità delle bande di una proteina e del controllo del caricamento e poi si fa il rapporto tra le due per normalizzare i campioni. Dopo avere eseguito l’analisi statistica, si costruisce un istogramma che consente una più chiara visualizzazione dei risultati.
4.9 ELISA
Il contenuto di VEGF è stato misurato usando il kit ELISA (R&D Systems, Min- neapolis, MN, USA), seguendo le istruzioni del produttore. Il saggio immunologico che permette di quantificare il VEGF di topo è un test della durata di 4.5 h che per- mette di misurare il contenuto di VEGF di topo nel surnatante di colture cellulari, di omogenizzati di tessuto, nel siero di topo e nel plasma. Prima di effettuare il test è necessario portare i reagenti ed i campioni a temperatura ambiente ed effettuare per ogni campione e standard un’analisi in duplicato. Si procede rimuovendo le file di micropiastre in eccesso ed aggiungendo a quelle utilizzate 50 ţL di Tampone Di- luente. Ad ogni pozzetto vengono aggiunti 50 ţL di Standard, controllo o campione, poi si coprono con il foglio sigillante e si incubano a temperatura ambiente per 2 h. Si procede aspirando e lavando ogni pozzetto per 5 volte totali. Si aggiungono 100 ţL di coniugato in ogni pozzetto, si ricopre la piastra e si incuba per 2 h a temperatura ambiente. Al termine si procede con aspirazione e lavaggio per 5 volte. A questo punto vengono aggiunti 100 ţL di Soluzione substrato ad ogni pozzetto e si incuba a temperatura ambiente per 30 min, facendo attenzione che la piastra sia protetta dalla luce. Si termina aggiungendo 100 ţL di Stop Solution ad ogni piastra ed effettuando la lettura allo spettrofotometro, entro 30 min, usando come lunghezza d’onda 450 nm con correzione a 540 o 570 nm.
4.10 Immunoistochimica
L’immunoistochimica è stata effettuata usando anticorpi policlonali di coniglio anti- 3-AR (1:50), anti-caspasi 3 attiva (1:200) e di ratto anti-CD31 (1:50). Le immagini sono state acquisite con il microscopio laser confocale (Leitz, Wetzlar, Germany) oppure in epi-fluorescenza con la fotocamera digitale Axiocam MRC (Carl Zeiss AG, Jena, Germany) usando un obiettivo 40x plan-Neofluar ed il software Axiovi- sion 4 (Carl Zeiss AG). Le immagini acquisite sono state valutate ed ottimizzate per contrasto e luminosità usando Adobe Photoshop (Adobe Systems, Mountain Views, CA, USA). Le analisi quantitative sono state effettuate usando delle im- magini normalizzate come background e misurando i valori in 10-16 aree, ognuna misurante 1.5 mm2, di due melanomi differenti per ogni condizioni sperimentale.
L’immunoistochimica è stata effettuata usando un anticorpo di coniglio verso 3-AR, un anticorpo di ratto diretto verso CD31 (BD Pharmingen, San Diego, CA, USA),
che colora le cellule endoteliali dei vasi sanguigni, un anticorpo di coniglio diretto verso la caspasi-3 attiva (Cell Signaling Technology, Beverly, MA) ed un appropria- to anticorpo secondario coniugato con un colorante fluorescente Alexa Fluor (Alexa Fluor 546 o Alexa Fluor 488). I tumori sono stati fissati in 4% di paraformaldeide e crioprotetti in 25% di saccarosio. Le sezioni criostatiche di melanoma sono state effettuate a 10-16 m, inserite tra vetrini rivestiti di gelatina e conservate a -20řC.
4.11 Statistica
Il significato statistico è stato valutato usando il Test t-Student o ANOVA seguendo il “Newman-Keuls Multiple Comparison post-test”. Per effettuare l’analisi statistica sulle immagini ottenute tramite l’analisi computerizzata della presenza delle proteine nei diversi campioni è stato utilizzato il software Graph-Pad, versione 4. I risultati sono stati considerati significativi a P<0.05 ed espressi come valore ś SEM di n valori indicati.