Attività antiossidante 1 Test in vivo

L’attività antiossidante degli estratti di Pistacia lentiscus è stata studiata utilizzando un modello in vivo sui ratti in collaborazione con i Dipartimenti di Citomorfologia, Neuroscienze, Biologia Sperimentale sez. Fisiologia (Università di Cagliari, Italia) e con i laboratori della società Nutrisearch srl (Pula, Italia).

Lo studio è stato realizzato utilizzando un modello di danno ossidativo provocato da ischemia celebrale indotta da occlusione delle carotidi.

Il complesso protocollo utilizzato è dettagliatamente riportato in [12].

In particolare è stato valutato, mediante tecnica analitica HPLC, il contenuto in acidi grassi altamente insaturi (HPUFAs) estratti da differenti aree del cervello e dal plasma.

2.5.1.2. Test in vitro su linee cellulari umane

In collaborazione con il Dipartimento di Scienze Biomediche e con il Centro di Eccellenza per lo Sviluppo di Biotecnologie e Ricerche sulla Biodiversità (Università di Sassari, Italia), sono stati eseguiti i test, in vitro con linee cellulari umane, di attività antiossidante sugli estratti di Salva desoleana.

Protocollo utilizzato Reattivi:

I sali per il tampone fosfato salino (PBS; 120 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 8.5 mM NaH2PO4, 1.5 mM KH2PO4, pH 7.3), e glucosio, collagenasi e dimetilsolfossido

foetal calf serum, new-born calf serum, penicillina, streptomicina, amfotericina e glutamina sono stati acquistati da GIBCO, Invitrogen. Per il test CyQUANT® NF, 2’,7’-

diclorodiidrofluoresceina diacetato (H2DCFDA) ed il kit CyQUANT® sono stati

acquistati da Molecular Probes (Eugene, OR, USA). La linea cellulare ECV304 proviene dall’European Collection of Animal Cell Cultures (Salisbury, UK).

Colture cellulari e trattamenti:

Le HUVEC sono state ottenute dalla vena del cordone ombelicale, secondo il metodo descritto da Jaffe [54], modificato. Le vene principali dei cordoni ombelicali sono state accuratamente lavate con PBS e poi incubate con 0.2 % di collagenasi nel terreno M199 addizionato con antibiotici (10000 µg/ml penicillina, 25 mg/mL streptomicina, 0.85 % amfotericina) per 10 min a 37 °C. Lo strato di cellule endoteliali è stato lavato dalle vene con PBS. Quindi le cellule sono state pellettizzate mediante centrifugazione e seminate in coltura sul terreno M199 addizionato con 100 U/ml penicillina, 25 mg/mL streptomicina, 0.85 % amfotericina, glutammina 2 mM, 10 % foetal calf serum and 10 % new-born calf serum. Le cellule sono state coltivate in palloni a 37 °C, 90 % di umidità, e CO2 al 5 % per 3-5 giorni. Le HUVEC sono state identificate dalla loro particolare

morfologia e mediante la colorazione del fattore VIII. Le cellule così ottenute sono state utilizzate per gli esperimenti a 90 % al 100 % di confluenza apparente, al primo o al secondo passaggio. Per tutti gli esperimenti, sono stati utilizzati gruppi di cellule estratte da differenti cordoni ombelicali.

Le cellule ECV304 sono una linea di cellule endoteliali immortalizzate, spontaneamente trasformate, dalla vena del cordone ombelicale. Sono state coltivate in terreno M199 integrato con 10 % foetal calf serum, 100 U/ml penicillina, 25 mg/ml streptomicina, e 0.85 % amfotericina. Le cellule ECV304 sono state mantenute in un incubatore per colture standard con aria umidificata contenente 5 % di CO2 a 37 °C.

l’estratto di S. desoleana è stato solubilizzato in DMSO allo 0.1 %. Misure di specie reattive dell'ossigeno intracellulari:

I livelli di ROS intracellulari sono stati determinati utilizzando la specifica sonda molecolare H2DCFDA. All'interno della cellula, l’esterasi si attacca ai gruppi acetato di

trattamento, le cellule sono state incubate per 30 min con PBS plus (PBS con 0.5 mM

CaCl2, 1 mM MgCl2, 30 mM di glucosio) contenente 1 mM H2DCFDA, e poi lavate con

PBS. I trattamenti sono avvenuti con differenti concentrazioni di dell'estratto S. desoleana (0.1, 1. 10 µg/mL). Le misurazioni di fluorescenza sono state effettuate in un lettore per micropiastre (Tecan Mannedorf, Svizzera), utilizzando una lunghezza d'onda di eccitazione di 485 nm, e una lunghezza d'onda di emissione di 535 nm. Le variazioni di fluorescenza indotte dal trattamento sono state misurate cineticamente, ogni minuto per 120 min consecutivi.

Tutte le misurazioni di fluorescenza sono state corrette per la fluorescenza dovuta al fondo. I risultati sul potere antiossidante e pro-ossidante sono stati valutati, utilizzando cellule non trattate come riferimento, per confronto di cinque misurazioni e quindi espressi come percentuale rispetto al controllo non trattato

Misurazione della proliferazione cellulare:

La proliferazione cellulare è stata valutata mediante analisi del contenuto di DNA cellulare utilizzando il kit di analisi CyQUANT ® NF, capace di legare un colorante fluorescente al DNA, in quanto il contenuto di DNA cellulare è strettamente proporzionale al numero di cellule. Dopo il trattamento con gli estratti di S. desoleana, il mezzo di crescita delle cellule è stato rimosso e sostituito con la soluzione colorante- legante. Dopo un’incubazione di 40 min, le misurazioni di fluorescenza sono state effettuate in un lettore per micropiastre (Tecan Mannedorf, Svizzera), utilizzando una lunghezza d'onda di eccitazione di 485 nm, e di emissione di 535 nm.

2.5.1.3. Test free radical scavenging

In collaborazione con il Laboratorio di Farmacognosia, Facoltà di Farmacia (Università di Monastir, Tunisia) sono stati eseguiti i test di attività antiossidante sugli estratti di Juniperus phoenicea, J. oxycedrus ssp. rufescens e J. oxycedrus ssp. macrocarpa.

Protocollo utilizzato

L'attività antiossidante antiradicalica è stata valutata mediante il test con difenilpicrilidrazile (DPPH) ed il test con acido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6- sulfonico) (ABTS). I valori ottenuti, analizzati mediante analisi della varianza (ANOVA), rappresentano le medie delle determinazioni in triplicato di tre test indipendenti.

Test DPPH:

Il test sull’attività di contrasto ai radicali liberi DPPH è stato eseguito secondo la metodica riportata da Ceel et alt. [55], apportando alcune modifiche. Gli estratti da testare preparati a diverse concentrazioni (1, 3, 10, 100 e 150 µg/mL), sono aggiunti ad una soluzione in etanolo di DPPH˙ 0.06 mM e la miscela di reazione viene agitata vigorosamente. Dopo incubazione per 30 min a temperatura ambiente, per via spettrofotometrica viene letta l’assorbanza a 517 nm. La soluzione di controllo, senza gli estratti, viene preparata e misurata con le stesse modalità. L’entità della decolorazione della soluzione è presa come indice dell’efficienza degli estratti nell’eliminazione dei radicali liberi (free radical scavenging).

L'attività antiossidante degli estratti è stata calcolata come effetto inibitorio (IE %) sulla formazione del radicale DPPH secondo la relazione:

IE(%) = 100 x (A517 sample) – (A517 control) / (A517 control)

(A517 sample) e (A517 control) rappresentano rispettivamente l’assorbanza a 517 nm dei campioni contenenti l’estratto e del controllo.

Il parametro IC50 (%) è stato definito come la concentrazione (µg/mL) dell’estratto

necessaria per ridurre il radicale DPPH˙ del 50 %.

Test ABTS:

La misura dell’attività antiradicalica è stata eseguita utilizzando il saggio di decolorazione del radicale libero ABTS˙+ in accordo con la metodica sviluppata da Re et al. [56], con alcune modifiche. Il radicale monocationico ABTS˙+ è stato generato

con EtOH per ottenere l'assorbanza di 0.7 ÷ 0.2 unità a 734 nm. I campioni degli estratti sono stati diluiti in EtOH per ottenere le differenti concentrazioni da testare (0.625, 1.25, 2.5, 5.75, 12 e 20 mg/mL). Per misurare l'attività antiossidante degli estratti, 10 µl di ciascun campione alle varie concentrazioni è stato aggiunto a 990 µL di soluzione diluita di ABTS˙+. L'assorbanza è stata misurata spettrofotometricamente a 734 nm dopo 30 min.

È stata calcolata la riduzione percentuale dell’assorbanza (decolorazione della soluzione) a 734 nm per ogni concentrazione di estratto e la capacità antiossidante è stata espressa come percentuale di inibizione (I %) calcolata secondo la relazione:

I(%) = (Ax – A0) / A0

Ax e A0 rappresentano rispettivamente l’assorbanza a 734 nm dei campioni contenenti l’estratto e del controllo.

Il parametro IC50 (%) è stato definito come la concentrazione dell’estratto necessaria

per ridurre ABTS˙+˙ del 50 %.

È stata valutata anche la capacità antiossidante equivalente Trolox (TEAC) [57] confrontando la variazione di assorbanza a 734 nm in una miscela di reazione contenente un campione di estratto vegetale con quella contenente Trolox. Questo indice è definito come la concentrazione millimolare di una soluzione Trolox la cui capacità antiossidante è equivalente a 1.0 mg dell'estratto.