Caratterizzazione degli oli essenzial

La caratterizzazione degli oli essenziali in passato si è basata [39,40], oltre che sull’esame organolettico, soprattutto su determinazioni di parametri quali: colore, limpidezza, densità, potere rotatorio, indice di rifrazione, residuo all’evaporazione, indice di acidità, indice di esteri ed in seguito anche alla cromatografia liquida TLC e su carta, etc… La determinazione della composizione qualitativa e quantitativa degli oli essenziali risultava, in passato, spesso un’operazione alquanto laboriosa e non priva di difficoltà. Solo in tempi relativamente recenti si è potuto far uso di tecniche analitiche strumentali che grazie al rapido progresso scientifico/tecnologico attualmente permettono di ottenere ottimi risultati.

I moderni metodi analitici per la caratterizzazione chimica degli oli essenziali sono principalmente basati su tecniche cromatografiche, anche se un importante contributo è

dato anche dalla risonanza magnetica nucleare 13C NMR [41]. La spettrometria di massa

trova la sua migliore applicazione accoppiata alla cromatografia in fase gas (GC-MS) ma anche in fase liquida (LC-MS) [42].

Applicazioni più avanzate come ad esempio fast CG, cromatografia chirale e multidimensionale (GC e LC), unite a sofisticati algoritmi di elaborazione dati (deconvoluzione, analisi multivariata, etc..) [43,44] trovano sempre più diffusione nell’analisi degli estratti di origine vegetale.

2.4.1.1. Caratterizzazione qualitativa

La tecnica scelta per l’analisi degli estratti volatili è la cromatografia in fase gassosa (GC), per quanto riguarda le buone capacità separative e la possibilità di determinazioni quantitative, accoppiata alla spettrometria di massa (MS) che ha come caratteristica principale l'alta sensibilità e l'ottima capacità di identificazione.

Per la separazione dei componenti l’olio essenziale si utilizzano colonne capillari sia apolari contenenti dimetilpolisilossano (es. DB-1, HP-1, SPB-1) o poli(5 % difenil 95 % dimetil)silossano, che migliora la stabilità termica della fase (es. DB-5, HP-5, SPB-5), che polari contenenti polietilenglicol (es. Carbowax 20M, HP-INNOWax, Supelcowax 10); queste colonne hanno sensibilità ed efficienza elevate e consentono la separazione del maggior numero possibile di componenti la miscela (> 150.000 piatti teorici).

Dopo la separazione GC, i componenti la miscela sono evidenziati nel cromatogramma dai singoli picchi, ad ognuno dei quali è associato un tempo di ritenzione tR (dipendente anche dalle condizioni d’uso dello strumento e quindi non

utilizzabile a scopo di confronto con analoghi dati di letteratura) o meglio un indice di ritenzione, parametro al tR associato. Tale indice permette di ottenere, per ogni

componente, un valore indipendente dalle caratteristiche geometriche delle colonne, per ogni fase stazionaria e temperatura. L’effetto della temperatura può essere trascurato qualora si lavori con fasi stazionarie apolari. Gli indici di ritenzione più utilizzati sono quelli logaritmici di Kovats [45] che è stato sviluppato per condizioni di separazione isoterme e quello lineare di van den Dool e Kratz [46] per le separazioni non isoterme con rampa di temperatura programmata.

Nella pratica gli indici di ritenzione sono calcolati sulla base dei tempi di ritenzione, ottenuti nelle stesse condizioni cromatografiche, di un composto sconosciuto i e di due n-alcani, secondo le formule:

z + ) (t ) (t ) (t ) (t = KI z R + z R z R i R × × − − 100 100 log log log log 1

(indice logaritmico di Kovats)

z + ) (t ) (t ) (t ) (t = LRI z R + z R z R i R × × − − 100 100 1

(indice lineare di van den Dool e Kratz) dove z e z+1 sono il numero di atomi di carbonio degli alcani che eluiscono

Gli indici di ritenzione così calcolati sono riproducibili, a parità di condizioni cromatografiche, con sufficiente precisione e possono essere utilizzati come parametro comparativo per l’identificazione dei componenti la miscela.

Le condizioni di separazione usate per gli oli essenziali normalmente prevedono l’uso della rampa di temperatura programmata; l’uso degli indici di ritenzione lineari (LRI) si rivela lo strumento ideale per identificare i componenti l’olio essenziale [47]. Si noti che nella letteratura concernente gli oli essenziali molto spesso sono riportati i valori degli indici di ritenzione logaritmici (KI), nonostante questi trovino la loro applicazione ottimale nelle separazioni isoterme. I valori degli indici di ritenzione dei diversi composti sono normalmente calcolati per analisi diretta di miscele standard di -alcani, anche se sul mercato sono disponibili banche dati sia generiche sia specializzate [48,49].

Nel caso si utilizzi solo un GC con detector FID o TCD, l’identificazione dei componenti tramite il solo indice di ritenzione (tecnica monodimensionale) può non essere totalmente affidabile e pertanto si preferisce utilizzare in contemporanea anche gli indici di ritenzione ottenuti, dallo stesso campione con una colonna a differente polarità (tecnica bidimensionale).

Risultati migliori si ottengono ricorrendo allo spettrometro di massa come detector, che permette di associare lo spettro di massa relativo ad ogni componente eluito dalla colonna cromatografica e al suo indice di ritenzione; anche in questo caso la tecnica è da considerare come bidimensionale. Lo spettro di massa, ottenuto per frammentazione mediante impatto elettronico (EI), fornisce il maggior contributo ai fini dell'identificazione del componente. Il ricorso alla procedura manuale di analisi dettagliata delle frammentazioni non è una pratica applicabile nel caso della caratterizzazione di oli essenziali, in quanto si tratta di miscele complesse con un elevato numero di componenti che possono avere, per classi di composti, la stessa massa molecolare. La soluzione al problema è il ricorso a banche dati di spettri di massa con cui confrontare gli spettri ottenuti; il confronto non viene effettuato manualmente (è comunque una pratica frequente confrontare e sovrapporre manualmente gli spettri in banca dati con quello incognito) ma tramite degli algoritmi software che ci propongono le corrispondenze più probabili e che possono essere principalmente classificati in:

• teorici (interpretazione spettro, confronto di più tecniche spettroscopiche);

Da questi algoritmi sono derivati i vari software di ricerca che spesso prevedono una codifica di riduzione preliminare dello spettro incognito secondo criteri che esaltino la parte strutturalmente significativa dello spettro.

Il sistema di ricerca utilizzato è il PBM (probability based matching), di tipo comparativo che utilizza i criteri statistici di unicità e abbondanza (per ogni M/z) e algoritmi di retroaderenza (misura del grado con cui lo spettro incognito è contenuto nello spettro di riferimento) per fornire dei risultati graduati secondo una probabilità finale mediata secondo fattori di affidabilità, sicurezza e contaminazione.

L'utilizzo di una singola banca dati di spettri di massa spesso non è sufficiente e pertanto sono state utilizzate in contemporanea banche dati di tipo generale come NIST (~ 250000 spettri) [48] e specifiche per gli oli essenziali come Adams (~ 2200 spettri) [49] oltre alla piccola banca dati creata autonomamente con gli spettri ottenuti dagli standards puri a nostra disposizione (~ 100 spettri).

L’identificazione finale dei componenti l’olio essenziale avviene incrociando i dati relativi alla ricerca nelle banche dati di spettri di massa con gli indici di ritenzione per ogni componente rilevato nel cromatogramma. Per alcune matrici vegetali [17,18,19] è stato possibile determinare anche gli indici di ritenzione su di una seconda colonna a differente polarità.

Tutti gli output (dati cromatografici e ricerche sugli spettri di massa) confluiscono in un foglio elettronico, appositamente sviluppato, che elimina la possibilità di errori nei calcoli e facilita notevolmente l’indispensabile fase di revisione manuale della corretta attribuzione dei picchi.

2.4.1.2. Caratterizzazione quantitativa

La quantificazione dei componenti gli oli essenziali è solitamente ottenuta mediante il metodo della normalizzazione [50] assumendo fattore di risposta unitario per tutti i componenti. Le aree di ciascun picco, ottenute con un'accurata scelta dei parametri di integrazione del cromatogramma e assumendo che il detector abbia una risposta lineare, sono rappresentative della percentuale relativa associata a quel determinato componente la miscela. La scelta di non introdurre fattori di risposta per i componenti l'olio è in parte giustificata dal fatto che quasi sempre abbiamo effettuato l’analisi quantitativa a scopo di

Risultati più accurati si ottengono determinando, in via semplificata, i fattori di risposta: nel caso di un olio essenziale si scelgono un numero limitato di composti, uno rappresentativo di ogni classe e si determinano i relativi fattori di risposta che saranno applicati all’intera classe di appartenenza. Per es: myrcene, HM monoterpeni idrocarburici; eucaliptolo, OM monoterpeni ossigenati; γ-cadinene, HS sesquiterpeni idrocarburici; β-bisabolenolo, OS sesquiterpeni ossigenati; etc..

Il contenuto in sclareolo nell’estratto di Salvia desoleana, espresso come

µg (scla)/mg(ext), è stato determinato mediante tecnica GC-FID, utilizzando n-dodecano

come standard interno [50].

2.4.1.3. Strumentazione e condizioni operative

GC-MS: Gascromatografo Agilent 6890N con autocampionatore 7683 e iniettore split/splitless. Colonne capillari Agilent HP5-MS (5%phenyl-95%methylpolysiloxane) o HP1 (polydimethylsiloxane), entrambe 30 m × 0.25 mm i.d., spessore film 0.25 µm. Condizioni cromatografiche: programmata di temperatura da 60 °C, rampa 3 °C/min fino a 250 °C seguita da 20 min in isoterma, temperatura iniettore 250 °C, gas carrier He con flusso di 1.0 mL/min; volume campione 1 µL in modalità split (1:10). Il GC è accoppiato con lo spettrometro di massa a quadrupolo Agilent modello 5973 MSD detector con le seguenti condizioni operative: energia di ionizzazione 70 eV, corrente di ionizzazione 60 mA, temperatura sorgente ionizzazione impatto elettronico 230 °C, temperatura quadrupolo 150 °C, scan range: 35 ÷ 350 u, 4.51 scans/s. Software Agilent MSD ChemStation E.01.00.237

GC-FID: Gascromatografo Agilent 6890N con autocampionatore 7683 e iniettore split/splitless. Colonne capillari Agilent HP5 (5%phenyl-95%methylpolysiloxane) o SP1 (polydimethylsiloxane) e SupelcoWax10 (polyethyleneglycol), entrambe 30 m × 0.25

mm i.d., spessore film 0.25 µm. Condizioni cromatografiche: programmata di

temperatura da 60 °C, rampa 3 °C/min fino a 250 °C seguita da 20 min in isoterma, temperatura iniettore 250 °C, gas carrier He con flusso di 1.0 mL/min; volume campione 1 µL in modalità split (1:10). Il GC è dotato di detector a ionizzazione di fiamma (FID), temperatura 250 °C. Software Agilent ChemStation.