Salvia desoleana

L'interesse sulla Salvia desoleana, pianta erbacea perenne endemica della Sardegna, è dovuto in gran parte alla sua grande affinità con la Salvia sclarea [66] di cui sono già noti i potenziali utilizzi degli oli essenziali principalmente in campo farmaceutico e profumiero. In particolare la ricerca è stata focalizzata principalmente sullo sviluppo di un processo pulito di estrazione basato sulle tecnologie della “green chemistry” come l'estrazione con CO2 supercritico (SFE), al fine di massimizzare la resa in sclareolo,

diterpene appartenente al gruppo dei labdani (figura 29) dotato di elevata attività antimicrobica [67] e ampiamente utilizzato dall'industria profumiera [68]. Altro obiettivo perseguito è stato quello di valutare l'attività biologica, antiossidante ed antiproliferativa su modelli di cellule endoteliali umane, degli estratti supercritici ad alta pressione.

Le estrazioni sono state realizzate utilizzando campioni di S. desoleana provenienti da coltivazioni nella zona di Monti (nord Sardegna).

Figura 29. Struttura chimica dello sclareolo (Labd-14-ene-8,13-diol).

Per la messa a punto del processo SFE sono stati utilizzati l'impianto da laboratorio di Cagliari (capacità estrattore 0.3 L.) e per lo scale-up l'impianto pilota presso la Porto Conte Ricerche ad Alghero (capacità estrattore 5 L.). A scopo di confronto, su di un campione di S. desoleana è stata realizzata anche l'estrazione dell'olio essenziale per idrodistillazione (HD). Le rese globali di estrazione (tabella 6) sono superiori nel processo SFE a 90 bar rispetto a quello HD e aumentano ulteriormente al crescere della pressione nell'estratto SFE a 250 bar. Occorre precisare che mentre l’estratto supercritico a bassa pressione ha l’aspetto di un olio giallo paglierino ed è definibile olio volatile,

l’estratto ottenuto a pressione più elevata si presenta come un agglomerato eterogeneo di olio e materiale solido di consistenza cerosa, di colore giallo carico, costituito presumibilmente da idrocarburi, esteri, etc.. aventi massa molecolare > 400 u.

La caratterizzazione chimica (qualitativa e composizione %) è stata realizzata mediante analisi GC-MS (tabella 7), mentre per la determinazione del contenuto in sclareolo si è utilizzata la tecnica GC-FID con standard interno.

Campioni Resa %

Salvia desoleana idrodistillato 0.13

Salvia desoleana estratto supercritico a 90 bar 50 °C 4 ore 0.6 Salvia desoleana estratto supercritico a 250 bar 40 °C 4 ore 0.9

Tabella 6. Resa di estrazione S. desoleana.

La figura 30 mostra il confronto della composizione per i componenti principali nei differenti estratti di S. desoleana (HD, SFE 90 bar, SFE 250 bar). L'estratto supercritico a 250 bar è quello che mostra la più alta percentuale di sclareolo (75.4 %), contiene anche minori quantità di altri composti come: dotriacontano (8.4 %), vitamina E (5.9 %), nonacosano (2.4 %), terpenil acetato (0.6 %), germacrene D (0.5 %) ed eucaliptolo (0.2 %). L'estratto supercritico a 90 bar mostra una composizione simile all’estratto a 250 bar e in netto contrasto con la composizione dell'olio essenziale ottenuto per idrodistillazione che invece si caratterizza per una maggiore resa in composti idrofili come: linalolo (2.9 %) ed eucaliptolo (3.1 %) e per l'assenza, del tutto normale, di quelli più pesanti.

% area

Compound RIK

HD SFE 90 bar SFE 250 bar

Eucalyptol 1033 3.1 0.4 0.2 Linalool 1098 2.9 - - Terpenil acetate 1350 13.6 2.0 0.6 Germacrene D 1485 26.5 2.4 0.5 Sclareol 2221 5.0 74.6 75.4 Nonacosane, C29H60 2900 - 1.7 2.4 Dotriacontano, C32H64 3200 - 3.0 8.4 Vitamin E 3222 - 1.1 5.9

Il contenuto in sclareolo nei differenti estratti è stato per l'idrodistillato di 53.8 µg/mg mentre cresce di un ordine di grandezza nel SFE 90 bar con 540 µg/mg; nel SFE 250 bar si registra il contenuto più alto di sclareolo con 811 µg/mg.

Figura 30. Contenuto nei principali componenti negli estratti di S. desoleana ottenuti per idrodistillazione, SFE a 90 bar 50 °C, SFE a 250 bar 40 °C. La figura interna mostra il cromatogramma GC-MS dell’estratto SFE a 250 bar 40 °C.

Dall'esame dei dati ottenuti si evidenzia come l'estrazione SFE a 250 bar rispetto a quella a 90 bar presenti la migliore efficacia e la più alta selettività verso lo sclareolo, in quanto a 250 bar oltre al maggior contenuto (811 µg/mg vs. 540 µg/mg) si ha anche una maggiore resa totale di estrazione (0.9 % vs. 0.6 %); in pratica, partendo dalla medesima quantità di S. desoleana, lavorando alla pressione di 250 bar si è ottenuta una quantità di sclareolo doppia rispetto all'estrazione condotta a 90 bar.

I buoni risultati ottenuti possono spiegarsi in quanto l'estrazione SC-CO2 emula,

variando le condizioni di temperatura e pressione, le caratteristiche di un solvente organico e riesce ad estrarre meglio i componenti di più alta massa molecolare.

L'estratto SCCO2 a 250 bar è stato utilizzato per i test di attività biologica. Per i test

sono state impiegate due differenti linee cellulari: HUVEC (cellule endoteliali umane primarie della vena del cordone ombelicale) e ECV304 (cellule endoteliali immortalizzate ottenute per spontanea trasformazione dalla vena del cordone ombelicale umano). In primo luogo è stato importante verificare se gli estratti esercitano un'azione

tossica sulle cellule e quindi possano influenzare la proliferazione cellulare e la produzione intracellulare di specie radicali dell'ossigeno (ROS): infatti, la produzione intracellulare di ROS è strettamente correlata alla sopravvivenza cellulare, alla proliferazione e all'apoptosi [69].

La valutazione dell'eventuale citotossicità dell'estratto di S. desoleana, è stata fatta incubando le cellule in tre diverse concentrazioni, 0.1, 1.0 e 10 µ g/ml per 24 h a 37 °C. La vitalità cellulare è stata misurata utilizzando il test CyQUANT ® NF e confrontando con il bianco di controllo (0.1 % dimetilsolfossido DMSO). Dai risultati, riportati in figura 31, si vede che l'estratto SFE a 250 bar di S. desoleana non ha mostrato tossicità a nessuna delle concentrazioni testate.

Note: Compounds were incubated in the cells for 24 h. Cell viability was determined by CyQUANT® NF assay. Values are

reported as percentage of the vehicle control (0.1% DMSO). Data are expressed as percent of control. CTRL, untreated cells; H2O2,

hydrogen peroxide; SAL, Salvia desoleana extract.

Figura 31. Citotossicità degli estratti di S. desoleana verso ECV304 (A) e HUVEC(B).

La misura del ROS è stata effettuata utilizzando la sonda fluorescente H2DCFDA.

Cellule endoteliali (ECV304 e HUVEC) sono state preincubate con la sonda, H2DCFDA

1 µM e quindi trattate con tre differenti concentrazioni dell'estratto per 2 h in presenza di H2O2, 75 µM.

I risultati (figura 32) derivati da cinque serie di misure sono espressi come percentuale di cellule non trattate con il controllo (0.1 % DMSO). L'esposizione di

antiossidante rispetto alle cellule trattate solo con H2O2 (figura 32A). Analogamente il

trattamento con le stesse concentrazioni sulla linea cellulare HUVEC ha indotto un significativo effetto antiossidante rispetto alle cellule trattate solo con H2O2 (figura 32B).

Note: Endothelial cells were incubated with 1 µM H2DCFDA in PBS plus for 30 min and then treated for 2 h with different

concentrations of S. desoleana extracts in the presence of 75µM H2O2.. Data are expressed as percent of the vehicle control (0.1%

DMSO).

(A) Dose-response effect of S. desoleana extracts in the presence of H2O2 on intracellular ROS levels of ECV304.

(B) Dose-response effect of S. desoleana extracts in the presence of H2O2 on intracellular ROS levels of HUVEC.

CTRL, untreated cells; H2O2, hydrogen peroxide; SAL, S. desoleana extract.

(A–B) *Significantly different from the control and #significantly different from hydrogen peroxide (p < 0.05).

Figura 32. Effetto protettivo degli estratti di S. desoleana sulle linee cellulari ECV304 e HUVEC dallo stress ossidativo indotto da H2O2.

L'estratto è risultato efficace nel neutralizzare l'effetto stimolante sulla produzione di ROS, il miglior effetto si è ottenuto con la più alta dose (10 mg/ml). Questa proprietà osservata dell'estratto di S. desoleana può essere spiegata in parte attraverso l'azione antiossidante di alcuni componenti, come ad esempio sclareolo [70] e vitamina E che hanno dimostrato di essere efficaci donatori di idrogeno.

Inoltre, per analizzare l'eventuale effetto protettivo dell'estratto contro lo stress ossidativo in vitro, si è utilizzato un modello con H2O2 come induttore del danno

ossidativo misurando il contenuto cellulare di DNA di ECV304 e HUVEC con il test kit CyQUANT® NF. Le cellule sono state trattate per 24 h con dosi crescenti di dell'estratto di Salvia desoleana (figura 33A/B). I risultati rivelano che il trattamento con una dose di 10 µg/ml di estratto ha avuto un effetto citoprotettivo su entrambe le linee cellulari

Quindi, l'effetto antiossidante osservato per l'estratto di S. desoleana non diminuisce la quantità di radicali utili alla sopravvivenza delle cellule: infatti dopo 24 h di trattamento, il contenuto di DNA è sostanzialmente simile a quello delle cellule di controllo. È probabile che nel corso delle 24 h, le cellule siano in grado di ripristinare i meccanismi redox che permettono loro di sopravvivere a qualsiasi attacco ossidativo o riduttivo.

Note: The measurement of cellular DNA content was evaluated using the kit, CyQUANT® NF assay. Data are expressed as

percentage of the vehicle control (0.1% DMSO). Dose-response effect of S. desoleana extracts in the presence of 75 µM H2O2 on

proliferation of ECV304 (A) and HUVEC (B). CTRL, untreated cells; H2O2, hydrogen peroxide; SAL, S. desoleana extract.

#Significantly different from hydrogen peroxide (p < 0.05).

Figura 33. Effetto citoprotettivo dose-risposta dell’estratto di S. desoleana verso l’aggiunta di 75 µM H2O2.