Alcuni anni fa, le N-(benzil) indol-3-gliossilammidi 1 sono state descritte come una nuova classe di ligandi per il recettore delle benzodiazepine (BzR) (Figura 11) [89,90].
Figura 11.Struttura delle N-(benzil)indol-3-ilgliossilamidi 1, Imidazobenzodiazepine 2 e Pirazolochinoline 3
Questi composti mostrano un'affinità maggiore per il sottotipo delle BzR, rispetto alle isoformee. La SARs dei derivati indolici ha rivelato che gli effetti della sostituzione dei sostituenti R5 e X sull'affinità di 1 sono indipendenti. In particolare, l'affinità è
favorita con X = idrossi / metossi o alogeni, a seconda che la posizione 5 del nucleo indolico sia sostituito (R5 = Cl / NO2) o meno (R5 = H). Così mentre nella serie 5- Cl/NO2 l'affinità è ottimizzata da X= 3',4'-(OH)2 o 3',4'-(OMe)2, nella serie 5-H l'affinità più alta è stata ottenuta con gruppi elettronattrattori X= 4'-Cl. Questi dati sono stati interpretati assumendo che i ligandi nella loro interazione con il sito recettoriale, possono adottare due modalità di legame alternativi, chiamati A e B (Figura 12) [90].
N O R5 H O N H X 1 N N N R8 COOR O CH3 2 N N N R4 R8 O H 3
Figura 12. Ipotetici modi di legame dei modelli indolici A e B per BzR [90] nel modello topico/farmacologico di Cook
Nel tentativo di identificare nuovi ligandi che possiedono selettività per i vari sottotipi BzR, l'attenzione è stata rivolta alle indol-3-gliossilammidi N-sostituite, che si inseriscono nelle regioni lipofile LDI e L2 in misura diversa. L'approccio si è sviluppato, concentrandosi sulle differenze nelle proprietà di riconoscimento dei sottotipi BzR. In particolare, è stato suggerito che la topologia di base di questi sottotipi è altamente conservata, ad eccezione delle tasche lipofile L2 e LDI, le cui diverse dimensioni potrebbero giocare un ruolo nella determinazione della selettività [87]. In particolare, è stato proposto che le regioni LDi e L2 sono più larghe nei siti di legame 1e, rispetto
agli altri sottotipi. Di conseguenza, la piena occupazione di LDi e L2 può spiegare la selettività 1 e [91,92]. Un ottimo esempio di selettività è data dalle
imidazobenzodiazepine 2 (Figura 11) dotate di sostituenti ingombranti in posizione 8 come etinil e (trimetil)-etinil, che si inseriscono nella regione L2 [91,92]. Yu et al. hanno proposto che la simultanea occupazione di L2 e LDi possa promuovere la selettività , grazie ai dati di legame forniti da alcuni pirazolodinoline 3 (Figura 11) sostituite in entrambe le posizioni 4 e 8, con gruppi ingombranti e lipofili. Tuttavia, i fattori che determinano la selettività , non sono ben definiti, infatti lo stesso gruppo di ricerca
afferma che i ligandi BzR si legano fortemente al sito 1 della regione LDi, nonostante
questi si leghino anche ad altre aree lipofile del recettore [91,92]
Prendendo le benzilindolgliossilammidi 1a e 1b come composti di riferimento (Tabella 10), [89] per misurare le proprietà di riconoscimento delle tasche LDi e L2, sono stati sintetizzati i composti 4-11 (ottenuti variando il sostituente sulla benzilammide dell'anello fenilico) e i composti 12-14 (ottenuti sostituendo la funzione benzilica con gruppi alchilici) [94]. Tabella 10. n R5 R Ki (µM) or % inhibition (10M) 1a H CH2-C6H5 120 ± 11 1b NO2 CH2-C6H5 117 ± 12 4 NO2 CH2-C6H4-4'-CH3 88 ± 6 5 H CH2-C6H4-4'-CH2CH3 2160 ± 180 6 NO2 CH2-C6H4-4'-CH2CH3 42 ± 3 7 H CH2-C6H4-4'-Br 93 ± 8 8 H CH2-C6H4-4'-C≡CH 164 ± 10 9 NO2 CH2-C6H4-4'-C≡CH 28% ± 1 10 H CH2-C6H4-4'-C≡C-CH3 3275 ± 299 11 NO2 CH2-C6H4-4'-C≡C-CH3 0% ± 3 12 H (CH2)3CH3 3720 ± 30 13 NO2 (CH2)3CH3 110 ± 9 14 NO2 CH(CH3)2 57.8 ± 4 Diazepam 120 ± 11 Flumazenil 120 ± 11 N COCONHR R5 H
L'affinità di legame dei derivati indolgliossilammidici sintetizzati 4-14 al recettore BzR nelle membrane di cervello, è stata determinata mediante esperimenti di competizione con il suo agonista radiomarcato [3H]flumazenil [95] ed è stata espressa come valore di Ki solo per quei composti che inibivano il radioligando oltre l'80% ad una concentrazione fissa di 10 iM (Tabella 10).
La Tabella 10 elenca i valori di affinità dei nuovi derivati indolici 4-14 e quelle degli indoli di riferimento 1a e 1b. Questi dati mostrano che la stessa catena laterale dell'ammide produce diversi effetti di affinità, a seconda che la posizione 5 del nucleo indolico sia sostituito (R5 = NO2) o meno (R5 = H). Questo andamento di affinità conferma che la 5-NO2 indolgliossilammide si lega al BzR in modo diverso dal corrispondente derivato 5-H (rispettivamente secondo modalità A e B) (Figure 12).
Secondo le SARs finora delineate, la regione LDi sembra essere più lunga della L2, perchè la prima può ospitare i sostituenti lunghi in posizione 4 dei 5-H indoli 5, 8 e 10 (orientati secondo il modo B), mentre l'altro non può ospitare gli stessi sostituenti in posizione 4 dagli analoghi 5-NO2 6, 9, e 11 (orientati secondo il modo A).
Allo stesso modo come osservato per composti 4-11 N-benzilici, l'impedimento sterico è un fattore che determina l'affinità anche per i derivati N-alchilici 12-14. Tuttavia, nel secondo sottoinsieme, l'affinità sembra dipendere non solo dalla lunghezza e larghezza totale, ma anche dalla forma della catena laterale. Le stesse N-sostituzioni sono ancora tollerate, quando vengono introdotte nell'analogo 5-H 12, (con affinità micromolare secondo modalità B), confermando che la regione LDi è più lunga della L2, che dovrebbe avere una lunghezza precisa, con il risultato che l'affinità è nulla quando la catena laterale dell'ammide aumenta al di sopra di un certo valore soglia. La ramificazione della catena R è tollerata all'interno della tasca L1/L2, effettuata nel 5-NO2 derivato 14 (con affinità elevata o moderata secondo la modalità A). Questi dati possono essere correlati alle
diverse forme e volumi delle regioni L1/L2 e LDi. Per quanto riguarda questi indoli, la tasca L1/L2 potrebbe ospitare sia catene N-aromatiche o N-alchiliche laterali dei derivati 5-NO2 (orientati in modalità A), così come l'anello benzenico fuso dei derivati 5-H (orientati verso il modello B). Per contro la tasca LDi, è in grado di accogliere l'anello benzenico fuso dei 5-NO2 indoli e le catene laterali N-benziliche dei ligandi 5-H, ma non è stericamente adatto per diverse catene N-alchiliche degli indoli 5-H. In altre parole, nonostante sia più lunga (rispetto alla L2), la regione LDi sembra essere essenzialmente ampia e può essere approssimativamente descritta come una cavità "tipo benzile". In realtà, qualsiasi deviazione da questo sostituente "migliore" nei 5-H indoli, ha dato effetti sfavorevoli sull'affinità.
In accordo con quanto descritto, molti studi di modellistica molecolare 17,18 hanno dimostrato che la maggior parte dei ligandi del BzR occupa la regione LDi con le funzioni aromatiche (ad esempio, un anello di benzenico fuso B-carboline, composti CGS, diidropiridoindolici) o piccoli gruppi alchilici (ad esempio, un metile dello zolpidem e della triazolopirimidina CL 218872).
Sono stati saggiati alcuni rappresentativi derivati indolici (4, 5, 7, 8, 10, 12, 13 e 14), insieme ai composti di riferimento 1a e 1b, per la loro affinità verso i sottotipi 1,e
del BzR.
Tabella 11. n Ki (µM) or % inhibition (10M) a 122 2 1a 346 ± 29 39% ± 3 46% ± 5 1b 65 ± 5 32% ± 3 44% ± 4 4 31.3 ± 2 0,00% 0,00% 5 559 ± 44 1600 ± 145 40% ± 3 7 17 ± 1 81 ± 7 1445 ± 120 8 250 ± 19 414 ± 31 1154 ± 299 10 881 ± 78 16% ± 2 13% ± 3 12 1175 ± 95 7% ± 1 28% ± 2 13 125 ± 10 553 ± 45 943 ± 80 14 15 ± 1 175 ± 12 498 ± 37 Zolpidem 50 ± 3 765 ± 63 35% ± 3
Esiste una buona correlazione tra le affinità wild-type e quelle sottotipo recettoriale1. Il
miglior risultato in termini di affinità e selettività, è rappresentato dal composto 4, che mostra una Ki di 31.3 µM verso il sottotipo1 e di non legarsi alle isoformeo.
Questi dati indicano che le indolgliossilammidi, a causa della loro forte interazione con la regione lipofila LDi (in una delle modalità di legame A o B), mantengono la selettività 1
indipendentemente dal grado di interazione con le tasche lipofile L1 / L2. Ciò è in accordo con quanto riportato in letteratura, dove è stato osservato lo stesso effetto in diverse serie di ligandi come le β-carboline [96] e i pirazolo[4,3-c]idrossi-3-oni
[92,93,97]. Il composto 4 è stato selezionato per essere sottoposto a screening per l'efficacia funzionale, e come illustrato in figura 2, la sua efficacia su co-applicazione con GABA al sottotipo BzR, era simile a quella dello standard diazepam (72% ± 2% e 78% ± 3% per il composto 4 e diazepam, rispettivamente), mostrando che la caratteristica principale del composto 4 è quello di essere un agonista di questo sottotipo recettoriale.
Grazie al suo profilo di efficacia, il composto 4 dovrebbe esercitare effetti sedativi in vivo. Questa ipotesi è stata inizialmente valutata con un modello comportamentale basato sulla rilevazione dell'attività motoria spontanea dei topi,[98] impiegando lo zolpidem 1-
selettivo [99] come farmaco di riferimento e i risultati hanno mostrato che il composto 4, anche se meno attivo dello zolpidem, è un agente sedativo-ipnotico. In conclusione, nessuna delle modifiche strutturali finora realizzate sulle indolgliossilammidi ha dato alcun spostamento di selettività dal sottotipo 1 verso il sottotipo o , confermando
così che un ligando che occupa favorevolmente la regione LDi mostra selettività verso 1,
nonostante le sue interazioni con altre aree lipofile nella tasca di legame del recettore. Il composto 4 è stato identificato come un ligando selettivo1 mostrando così un profilo di