Binding del SERT con [ 3 H]-paroxetina.

Il binding è un dosaggio biochimico quantitativo molto sensibile che permette lo studio delle interazioni ligando-recettore (L-R).

Il complesso L-R è quindi formato da: i) un ligando, ovvero una molecola, farmaco, composto endogeno, neurotrasmettitore che si lega a siti precisi del recettore; ii) un recettore, intendendo con questo termine, tutte quelle proteine che hanno siti specifici di legame e riconoscimento (binding sites); tra queste, vi sono i classici recettori appartenenti a tutte le superfamiglie note (metabotropici, ionotropici) ed anche i trasportatori o carrier di membrana, responsabili del passaggio delle molecole dall’ambiente intra- od extra-cellulare e della loro compartimentalizzazione subcellulare. La tecnica utilizza un ligando marcato con un isotopo radioattivo che viene lasciato ad incubare in opportune condizioni con la preparazione biologica contenente il sito recettoriale in studio. La marcatura del ligando avviene per sostituzione di un atomo con un radioisotopo in una posizione che non ne altera la capacità di binding. Il radioligando deve avere 3 importanti caratteristiche: alta affinità, alta selettività ed attività specifica per il substrato recettoriale.

Esistono varie modalità e tecniche di binding recettoriale che consentono sia di identificare e localizzare proteine in cellule o frazioni subcellulari sia di determinare vari parametri biochimici, quali:

 affinità del farmaco/sostanza con il recettore (Kd),

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Bmax)

 le caratteristiche dell' interazione ligando/recettore (costanti cinetiche)

 il numero di popolazioni recettoriali coinvolte nel legame

 il profilo e le caratteristiche farmacologiche del recettore.

La formazione del complesso ligando/binding-sites è una reazione reversibile che segue la legge di azione di massa ed è caratterizzata da una propria costante di associazione e dissociazione.

I due principali parametri che si valutano con la tecnica standard di binding sono la Kd e la Bmax. La Kd, o costante di dissociazione del complesso, ha le dimensioni della concentrazione a cui un determinato ligando occupa il 50% dei siti recettoriali all'equilibrio: è correlata in modo inversamente proporzionale all'affinità del ligando per il sito proteico, in quanto ad un aumento della Kd consegue una diminuzione dell'affinità. La Bmax è invece corrispondente alla densità dei siti di legame ed è indicata come numero massimo di molecole che si possono legare nel tessuto, quindi correlata al numero dei binding- sites presenti; viene espressa come fmoli/mg di proteine presenti. Mediante questa tecnica, la concentrazione dei siti proteici rivelabile è nel range delle fmoli o pmoli: quindi, utilizzando ligandi radioattivi non solo selettivi ma anche dotati di alta attività specifica, il binding riesce a misurare recettori o proteine d’interesse presenti anche in tracce nei campioni biologici.

La metodica prevede l'incubazione di una preparazione, contenente il sito proteico in esame, con un opportuno radioligando, scegliendo tempi, pH, temperatura e concentrazione proteica del preparato ottimali, tali da permettere il raggiungimento dell'equilibrio ed un legame sufficientemente apprezzabile.

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formato il complesso L-R che può essere separato per filtrazione sottovuoto. Con la filtrazione viene anche eliminata la quantità in eccesso di ligando libero che non si è complessato: i filtri trattengono il complesso mentre il radioligando libero passa attraverso il filtro. I filtri contenenti il complesso L-R marcato vengono poi misurati per la loro radioattività mediante uno scintillatore tipo β-counter in caso di radioligandi marcato con isotopi β-emittenti, permettendo di ricavare il legame ligando-siti recettoriali. La misura del legame specifico non è tuttavia diretta: deve essere infatti sempre valutato il legame aspecifico del radioligando sul filtro. Il legame aspecifico è dato dal legame residuo, rilevato per ogni concentrazione di radioligando utilizzata, ottenuto utilizzando un forte eccesso di ligando non marcato per spiazzare tutti i siti saturabili del recettore. Come spiazzante può essere impiegato anche un composto diverso dal radioligando a condizione che riconosca i siti recettoriali in studio. L’uso di spiazzanti opportuni può contribuire alla caratterizzazione dei siti di legame misurati.

Il binding specifico viene quindi calcolato per differenza tra il legame totale ed il legame aspecifico, che deve essere il più basso possibile. In genere, un buon legame specifico è rappresentato dal 70-80% rispetto al legame complessivo.

Nel nostro caso, sono state adottate condizioni sperimentali già note per il modello del SERT piastrinico e che consentono l’ottenimento di risultati ottimali di legame specifico. E’ stato utilizzato il radioligando [3H]-paroxetina, ritenuto dalla comunità scientifica come il miglior tracciante per studiare e caratterizzare le proprietà di legame del SERT, in quanto questo composto è un antidepressivo SSRI ad affinità molto elevata ed altamente selettivo per il trasportatore.

Il binding è stato condotto in questo modo: aliquote di 100 μl di membrane piastriniche (80-100 μg di proteine) sono state incubate per

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60 min a temperatura ambiente in una serie di provette contenenti concentrazioni crescenti di [3H]-paroxetina (0,01 nM-1 nM) in un volume finale pari a 2 ml di tampone contenente Tris-HCl 50mM, KCl 5 mM, NaCl 120 mM, pH 7,4. Il legame aspecifico è stato determinato utilizzando come spiazzante l’SSRI fluoxetina in eccesso, alla concentrazione di 10 µM. Trascorso il tempo di incubazione, le provette di dosaggio sono state filtrate rapidamente sottovuoto su filtri di fibra di vetro Wathman GF/C, procedura seguita poi dal lavaggio dei filtri per 3 volte con 5ml di tampone di dosaggio a freddo. Per la filtrazione è stato utilizzato un apparecchio di filtrazione simultanea tipo Brandel, costituito da un sistema multicanale per l’aspirazione dei campioni e la disposizione dei filtri, operante sottovuoto. I filtri con la radioattività trattenuta sono stati poi posti in apposite pony vials di plastica aggiungendo 4 ml di liquido di scintillazione. Le vials sono state agitate e poste in uno scintillatore in fase liquida, un β-counter Packard 1600-TR. La radioattività è stata rilevata come disintegrazioni per minuto (dpm).