BREVE APPROFONDIMENTO SULLE ANALIDI DEI CAMPIONI E LE TECNICHE DI MISURAZIONE

Immunofenotipizzazione e citofluorimetria

Per l’immunofenotipizzazione il campione ematico è stato raccolto in una provetta EDTA ed analizzato dal laboratorio di Citofluorimetria dell’Unità Operativa di Ematologia Universitaria dell’AOUP.

E’ stata eseguita un’analisi immunofenotipica a sei fluorescenze con procedura di gating CD45/SCC con citofluorimetro FASCanto II a 3 laser.

Sono stati utilizzati 2 pannelli anticorpali, ciascuno dei quali formato da 6 anticorpi monoclonali specifici per un cluster di differenziazione legati ad altrettanti fluorocromi, in modo da analizzare contemporaneamente l’espressione sulla superficie cellulare di diversi cluster (CD).

I fluorocromi utilizzati per identificare i cluster di tipizzazione sono riassunti nella Tabella X.

Tabella 7: Tipizzazione

Tipizzazione CD caratteristico CD-fuorocromo

Linfocita T*** CD3+ CD3-PERC-cp

Linfocita T Helper * CD3+ CD4+ CD3-PERC-cp CD4-FITC

Linfocita T Citotossico* CD3+ CD8+ CD3-PERC-cp CD8-V450

Linfocita T Regolatore* CD3+CD4+CD25+CD127low CD3-PERC-cp CD4-FITC CD25-PECy7 CD127-PE

Linfocita T Helper

CD127+**

CD3+CD4+CD127+ CD3-PERC-cp CD4-FITC

79 Linfocita T citato CD127+** CD3+ CD8+ CD127+ CD3-PERC-cp CD8-V450 CD127-PE Linfocita NK*** CD3- CD56+ CD56-APC Linfocita B*** CD19+ CD19-PECy7

Linfocita B attivato* CD19+ CD23+ CD19-PECy7 CD23-PE

Monocita CD14+ CD14-V450

Monocita attivato**** CD14+ HLADR+ CD14-V450 HLADR-PerCP

Neutrofilo attivato***** CD64+ CD64-FITC

*espressi come percentuale entro la popolazione di linfociti T

**espressa come percentuale dei linfociti T CD4 o CD8+ che esprimonoCD127 ***espressi come percentuale entro la popolazione di linfociti totali

****espressi come percentuale dei monociti positivi per HLA-Dr entro la popolazione totale dei monociti *****espressi come percentuale dei neutrofili positivi per CD64 entro la popolazione dei neutrofili totali

Cenni di Citofluorimetria

La citometria a flusso è una tecnica per la misurazione e la caratterizzazione delle cellule sospese in un veicolo fluido che si muovono in flusso laminare. Il citometro individua le cellule singole e ne analizza le caratteristiche fisiche singolarmente.

I moderni citometri a flusso comprendono una fonte luminosa, un sistema ottico di rilevazione, un parte elettronica e un computer per tradurre i segnali in dati.

Le indagini diagnostiche citofluorimetriche sono eseguite marcando le cellule mediante anticorpi monoclonali associati fra loro nel cosiddetto pannello anticorpale. Ogni anticorpo monoclonale è marcato con uno specifico fluorocromo, il quale emette fotoni con particolare spettro di emissione. Il citofluorimetro individua le cellule e misura l’intensità di fluorescenza dei singoli fluorocromi attraverso analisi computerizzata. L’intensità della fluorescenza è in stretto rapporto con la quantità di anticorpo legato alle cellule. Con una singola provetta è possibile definire le caratteristiche antigeniche delle cellule in esame in pannelli che possono comprendere fino a otto anticorpi monoclonali alla volta.

Ogni gruppo di anticorpi monoclonali specifici per un antigene fa parte di un cluster di designazione e differenziazione, detto CD. Un numero specifica il tipo di antigene riconosciuto da tutti i cloni appartenenti allo stesso cluster.

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Il funzionamento del citofluorimetro a flusso può esser riassunto così: una sospensione cellulare monodispersa (ad esempio cellule da sangue periferico) viene convogliata da un sistema fluidifico di trasporto fino al punto di misura, dove incontra un fascio luminoso di alcune decine di micron, focalizzato tramite l’ausilio di una lente e proveniente da una sorgente di eccitazione. Quando il raggio intercetta il flusso cellulare (stream) vengono generati dei segnali dall’incontro di ogni singola cellula. Questi segnali sono legati alle caratteristiche fisiche delle particelle (diametro, rapporto nucleo/citoplasma, granulosità interna, rugosità di membrana), e all’eventuale presenza di molecole fluorescenti localizzate in diversi siti.

Una volta emessi, i segnali sono raccolti da un sistema di lenti, specchi dicroici e filtri ottici, e inviati ai rispettivi sensori (fotodiodi e fotomoltiplicatori) che ne misurano l’intensità.

Questi segnali elettrici, quindi analogici, vengono amplificati, digitalizzati, associati tra loto ed inviati ad un analizzatore/elaboratore di dati che provvede alla loro presentazione su un monitor e alla loro elaborazione statistica.

L’applicazione più comune del citofluorimetro riguarda la ricerca di markers cellulari di membrana (fluorescenza di superficie), ma è possibile ricercare anche markers intracellulari (citoplasmatici o nucleari) impiegando metodi di permeabilizzazione delle cellule, che permettano l’ingresso degli anticorpi marcati con i fluorocromi e allo steso tempo garantiscano la conservazione dell’integrità e delle caratteristiche di scatter delle cellule.

Il test citofluorimetrico routinario più frequentemente richiesto è la tipizzzazione linfocitaria. Consiste nella determinazione del fenotipo dei linfociti circolanti e fornisce informazioni utili nella diagnosi di: stati reattivi (virosi), presenza di linfociti clonali (linfomi non-Hodgkin leucemizzanti), infezioni da HIV (conteggio assoluto dei linfociti CD4+), anomalie fenotipiche in corso di stati congeniti o acquisiti di immunodeficienza. I sottotipi dei linfociti sono individuati mediante l’impiego di anticorpi monoclonali diretti contro specifici markers T, B ed NK.

Una volta conosciuta la percentuale dei singoli sottotipi linfocitari, è possibile calcolarne il numero assoluto in base al numero dei linfociti indicato dall’esame emocromo (analisi in “doppia piattaforma”).

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Siccome tutte le cellule del sistema emopoietico, ad eccezione di eritroblasti ed eritrociti, sono positivi per l’antigene leucocitario comune CD45, l’analisi citofluorimetrica deve esser effettuata previa esecuzione di un gate elettronico che comprenda solo gli eventi CD45+.

Figura 14 : Citometria a flusso

Dosaggio delle classi immunoglobuliniche e nefelometria

Per l’analisi dei livelli plasmatici delle immunoglobuline il campione ematico è stato raccolto in una provetta con granuli e clot activator da 5ml ed inviato all’U.O. Laboratorio di Analisi Chimico-cliniche dell’AOUP. Le immunoglobuline sono state misurate con tecnica nefelometrica. Le alterazioni dei livelli delle immunoglobuline sono stati definiti secondo il range utilizzato dal laboratorio:

classe di Ig Valori di riferimento

IgG 700-1600 mg/dl

IgA 17-400 mg/dl

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Cenni di nefelometria

La nefelometria è una metodica ottica di analisi che permette di ricavare la quantità di sostanza oggetto di analisi misurando la radiazione diffusa per effetto Tyndall. Le misure nefelometriche necessitano che il raggio luminoso in uscita dalla soluzione in esame sia convogliato su un rivelatore posto ad angolo retto rispetto alla direzione del raggio incidente, in modo da raccogliere il massimo livello di energia.

Viene applicata per fasi disperse estremamente fini, di diametro dell'ordine di decine o centinaia di nanometri.

Figura 15: Nefelometria

Valutazione dell’emostasi e tromboelastografia

Per la valutazione del quadro emostatico dei pazienti i campioni ematici (360 μg prelevati da accesso arterioso o CVC) sono stati analizzati nella UTI di provenienza con TEG point of care.

83 Valutazione dell’attività endotossinica e EAA™

Per la valutazione dell’attività endotossinica i campioni ematici sono stati raccolti in provette EDTA e inviati, entro 1 ora del prelievo, per essere analizzati entro 3 ore, al Laboratorio di Microbiologia dell’AOUP.

Cenni di Endotoxin Activity assay (vedi pag.19)