2.3 Evidenze sperimentali dei burst nei procarioti
2.3.1 Burst nei procarioti: l’esperimento di Golding et al
(2.54) Si può vedere che il parametro che descrive il numero medio di protei-ne prodotte in un burst di traduzioprotei-ne ( ˆA2) dipende da ben 4 rate biochimici. Differenti combinazioni di tali rate possono pertanto condurre allo stesso va-lore del parametro di burst; dal punto di vista matematico questo sancisce la non-identificabilità del rumore a partire dai dati inerenti la taglia dei burst. Ad esempio non è necessario avere una produzione in burst degli mRNA: se α1 ∼ β1, la produzione di trascritti è pressocché poissoniana. É possibile, però, avere una taglia dei burst significativa (hnpi 1) e grandi fluttuazioni nel caso in cui α2 β2. In questo caso siamo nel limite di piccolo numero di mRNA e alto livello di sintesi [39], che produce burst traduzionali.
2.3.1 Burst nei procarioti: l’esperimento di Golding et al.
Fino al 2005 si credeva che un dinamica trascrizionale a burst fosse tipica solo degli eucarioti, in cui il rimodellamento della cromatina e l’azione dei fattori trascrizionali producono una cinetica lenta per il promotore, causando perio-di perio-di attività (che costituiscono i burst) e lunghi perioperio-di perio-di inefficienza trascri-zionale. Nel 2005 Golding et al. [29] mostrano che anche i batteri possono
produrre mRNA in burst.
Golding et al. utilizzarono un costrutto MS2-GFP, ottenuto dal dimero covalente di rivestimento MS2 fusa con una proteina GFP, per tracciare di-rettamente le molecole di mRNA in E.Coli [24]. La proteina di rivestimento MS2, omonima del batteriofago che infetta l’E. Coli, è una delle 4 proteine prodotte dal genoma del fago MS2 – il genoma più piccolo conosciuto, solo 3569 nucleotidi di RNA a singolo filamento.
(a) green foci
(b) conteggio trascritti
Figura 2.7. Misurazione del livello di mRNA in cellule vive. (a)Immagine della rilevazione dei trascritti. Corrispondono alle green foci. (b) Distribuzione dl numero di copie di mRNA stimato tra differenti cellule in due ensemble. Immagini tratte da [29].
Tale proteina interagisce con la struttura a stem-loop dell’RNA, permetten-do in questa maniera il tagging del trascritto, e, grazie alla fusione con la Green Fluorescence Protein, la sua rivelazione mediante microscopio a epifluorescen-za o al microscopio confocale. Il trascritto, prodotto dal plasmide F presente in singola copia nella cellula, consiste in una molecola di mRNA che consiste in una regione che codifica una proteina che produce fluorescenza rossa, mR-FP1, seguito da una serie tandem di 96 binding site del MS2. Il promotore del gene che regola la produzione della MS2-GFP (PLtetO, costruito sul plasmide ColE1) e il promotore della mRFP1, Plac/ara, che è represso da Lacl e attiva-to da AraC, sono entrambi inducibili, ovvero possono essere controllati da fattori trascrizionali. L’utilizzo della tecnica di MS2 tagging permette il con-teggio diretto dei trascritti in vivo senza "filtrare" le fluttuazioni del livello di mRNA con la degradazione e la traduzione in proteine. Dunque hanno sti-mato il numero di molecole di mRNA misurando il flusso totale di fotoni sul background. Normalizzando il flusso sull’intensità luminosa di una singola molecola di mRNA – il primo picco nella Figura2.7b– calcolavano il numero di trascritti per cellula hni come funzione del tempo.
Figura 2.8. Numero medio di trascritti per cellula. In figura è presentato il numero medio di trascritti hnti in funzione del tempo, dopo l’induzione a t = 0. Simboli differenti sono rela-tivi a tre esperimenti indipendenti. La linea spezzata (ciano) consiste nell’andamento teorico che si ottiene considerando solo gli andamenti asintotici ∼ α1te ∼ α1/α2. La linea pun-teggiata si ottiene da simulazioni stocastiche, mentre la linea tratteggiata è l’andamento predetto dal modello2.55. In inset è presentata la deviazione relativa dallo stato stazionario in scala semilogaritmica. Immagine tratta da [11].
Prima di tutto, Golding et al. hanno studiato il sistema nello stato sta-zionario. LaFigura 2.8mostra il numero medio di trascritti per cellula nel tempo, dopo l’induzione. Per interpretare tale curva si è supposto un rate di produzione costante dei trascritti (α1) e un termine di reazione del primo ordine che tiene conto dell’eliminazione dei trascritti (con rate β2):
d dthn(t)i = α1− β2hn(t)i. (2.55) Risolvendo2.55si ottiene: hn(t)i = α1 β2 1 − e−β2t (2.56) da cui hn(+∞)i − hn(t)i hn(+∞)i − hn(0)i = e −β2t. (2.57)
Da2.57si evince che le fluttuazioni relative decrescono esponenzialmen-te e indipendenesponenzialmen-temenesponenzialmen-te da α1. In particolare, il termine di reazione in2.55 è legato alla divisione cellulare piuttosto che alla degradazione, per cui si ha β2 = ln(2)/τg. Allora, misurando il tempo di vita medio delle cellule si tro-va τg ≈ 50 min, da cui β2 = 0.014 ± 0.002min-1, in accordo con il valore trovato per β2dall’andamento esponenziale. Il valore di α1 derivava imme-diatamente dallo stato stazionario hn(+∞)i = α1/β2, da cui hanno trovato
α1 = 0.14 ± 0.02min-1.
Il più semplice meccanismo microscopico che produce un rate costan-te di produzione è un processo poissoniano. La probabilità di non avere trascrizioni dopo l’induzione (t = 0) per un processo di Poisson decresce esponenzialmente con il tempo (cfr.2.24e2.26):
P0(t) = e−α1t. (2.58)
Stimando la P0(t) come la frazione di cellule contenente zero trascritti, trovarono che la decrescita era esponenziale, ma con rate di decadimento ˜
k1 = 0.032 ± 0.005min-1, circa 4 volte più piccolo del rate α1trovato dai dati sulla distribuzione stazionaria. Da questo dedussero che il processo di produ-zione dei trascritti non è poissoniano. Questo risultato era in accordo con la misura indipendente del fattore di Fano, σ2/hni = 4.1 ± 0.5. Questo condusse gli sperimentatori a ipotizzare un modello di attivazione-disattivazione ran-dom del gene. Ipotizzarono, dunque, che lo stato del gene fosse caratterizzato da switch ON ↔ OFF, separati da intervalli temporali esponenzialmente di-stribuiti, esattamente come nel modello del telegrafo. In più il gene poteva trascrivere nel periodo ON, e la distribuzione del numero di mRNA prodot-ti è dunque geometrica (equazione2.48eD). La distribuzione geometrica è essenzialmente una distribuzione esponenziale a valori interi, pertanto ci si aspettava un andamento lineare in scala semilogaritmica. Per dimostrare di-rettamente l’esistenza dei burst Golding et al. seguirono la trascrizione nel tempo e calcolarono la statistica del numero di eventi in un burst e dei tem-pi di attesa. Essi trovarono effettivamente che la trascrizione è caratterizzata da periodi di inattività ∆tOF F, seguita da periodi di attività ∆tON che pro-ducono salti di altezza ∆n random nel livello di mRNA (vedi Figura 2.9). Hanno mostrato inoltre che le distribuzioni dei ∆tON e ∆tOF F sono accura-tamente descritte da esponenziali, con valori medi pari a h∆tONi ≈ 6 min e h∆tOF Fi ≈ 37 min. Anche la distribuzione dei ∆n risultava essere di tipo esponenziale (geometrica) con ∆n ≈ 2.2, dunque > 2, che verifica il model-lo a burst. Dunque i periodi ON sono brevi relativamente ai periodi OFF, e pertanto è facile pensare ad un modello semplificato in cui il processo di tra-scrizione è un susseguirsi di eventi poissoniani dove ciascuno aggiunge un numero di mRNA estratto da una distribuzione geometrica – del resto nella 2.48si perde la dipendenza dal tempo, per cui tale approssimazione non mo-difica la trattazione in maniera sostanziale. Allora è facile capire come il reale rate k0
1 = α1h∆ni−1, da cui si dovrebbe avere che il rate reale è circa 2-3 volte quello trovato con misure sullo stato stazionario. Questo risultato differiva leggermente da ciò che avevano ottenuto misurando P0(t)(k0
1 ≈ α1/4), ma gli autori hanno imputato tale discrepanza alle diverse condizioni sperimentali per le due misure.
(a)
(b) (c)
Figura 2.9. I burst trascrizionali. (a) In figura è mostrato il nu-mero stimato di trascritti per cellula, come funzione del tem-po, per quattro ensemble indipendenti. Le cellule sono state indotte a t = 0. Le immagini a fluorescenza sono state prese per 2 ore, 2 frames/min. In rosso i punti sperimentali della cellula prima e dopo la divisione cellulare, in blu il numero di trascritti nella cellula "sorella" dopo la divisione. In verde una curva tracciata prendendo il massimo in un finestra di sei da-ti, in nero una linea tracciata a mano, per mettere in evidenza i burst trascrizionali. (b) Distribuzione dei periodi di inatti-vità (∆tOF F, quadrati) e dei tempi di attività, cioè la durata dei burst (∆tON, triangoli), entrambi in scala semilogaritmica. La linea continua è un fit lineare (in ciano). (c) Distribuzione dei "salti" ∆n. Anche in questo caso il fit è lineare (in ciano). Immagini tratte da [29].
Figura 2.10. Schema del twin supercoiled domains model. É mostrato un RNA polimerasi che trascrive un dominio to-pologico isolato di DNA in mRNA. Si vede la formazione del supercoiling positivo in avanti e del supercoiling negativo all’indietro. Immagine tratta da [11].
Seppur ci fosse l’evidenza dei burst trascrizionali in cellule di E. Coli, gli autori non conoscevano le cause di una cinetica di questo tipo. Loro indivi-duarono molteplici possibili cause, tra cui l’azione degli attivatori (AraC) e dei repressori (Lacl), la ritenzione del fattore σ durante l’elongazione, i cambi conformazionali del DNA. Vedremo che una causa dei burst, invece, risulta essere sicuramente l’introduzione e la rimozione di supercoiling positivo per mezzo dell’RNAP e delle topoisomerasi, come hanno mostrato Chong et al. in un loro esperimento. Prima di mostrare l’esperimento di Chong et al. è bene però specificare quale sia il ruolo delle polimerasi e delle topoisomerasi nel controllo dell’espressione genica.