Proprietà geometriche del DNA circolare chiuso: twist

Sebbene il numero di Linking possa essere lo stesso, sono possibili differen-ti configurazioni spaziali del DNA chiuso, che generalmente non si presenta in forma planare. Questo è essenzialmente dovuto alla flessibilità del DNA,

9Questa condizione è importante. Infatti solo nel caso in cui l’asse del DNA è vincolato a

stare sul piano, allora è possibile definire Lk0in questa maniera. Altrimenti, come vedremo

nella sezione1.2.3, bisogna aggiungere un termine che tiene conto della curvatura intrinseca

Figura 1.18. Conformazioni superavvolte del DNA circo-lare chiuso. Conformazioni di DNA superavvolto ottenute mediante simulazioni Monte Carlo per un cerchio di DNA di lunghezza pari a 3.5 kb. Sono stati usati differenti valori del-la differenza specifica di linking (σ) e deldel-la concentrazione di Na+. A fissato valore di [Na+], un valore di supercoiling ne-gativo maggiore (σ = -0.06, [Na+] = 0.2M) causa la presenza di ramificazioni di DNA superavvolto, rispetto alla forma più "aperta" assunta ne caso di valori di supercoiling maggiori (σ = -0.03). Il valore di [Na⁺], invece, modifica il valore di Lk0, ma non la differenza specifica di linking. Perciò, a fissato valore di σ una diminuzione di [Na⁺] provoca una diminuzione di Lk0, ed una diminuzione di Lk, che può manifestarsi in una diminuzione prevalente del numero di Tw (σ = -0.06) o di Wr (σ = -0.03), oppure di entrambi. Immagine tratta da [11].

che gli permette di esibire supereliche qualora fosse superavvolto. É neces-sario dunque distinguere l’avvolgersi dei filamenti attorno al proprio asse, detto twist (Tw), dagli avvolgimenti dell’asse nello spazio, detto writhe (Wr). Una semplice ma importante relazione lega twist e writhe, che sono funzioni geometriche, con il numero di linking, che è invece una proprietà topologica:

Lk = T w + W r. (1.5)

Questa formula viene detta formula di Cˇalugˇareanu-White-Fuller. Si può notare dunque che Tw e Wr non sono necessariamente interi e non sono inva-rianti topologici. Il loro valore può infatti cambiare facilmente se cambiano le condizioni dell’ambiente, la temperatura e durante i processi che coinvolgo-no il DNA (Figura 1.18). Si può vedere che, se la molecola è forzata a stare su un piano – l’asse del DNA è dunque una curva nel piano – allora non si può avere writhing, e vale la relazione:

Si pensi ora ad un topoisomero rilassato, con Lk = Lkm. Tale topoisome-ro ha supercoiling non nullo¹⁰il quale può manifestarsi sotto forma di writhe, oltre che sotto forma di twist, come espresso daEquazione 1.5. Allora è uti-le definire il termine Tw₀, che è il twist della molecola lineare prima della chiusura:

T w₀= ^N

h^. (1.7)

La definizione appare identica a quella data per Lk₀ in (1.2). In realtà in 1.2.2abbiamo considerato molecole planari, per cui la (1.2) e la (1.7) coinci-dono, non potendo esserci writhe. Considerando invece una molecola non planare, ovvero una molecola circolare di DNA il cui asse non giace su un piano, bisogna considerare la possibile presenza di writhing intrinseco, per cui vale:

Lk₀ = T w₀+ W r₀ = ^N

h ^{+ W r0.} (1.8)

Combinando (1.5) E (1.8) si ottiene:

∆Lk = ∆T w + ∆W r (1.9)

che definisce la variazione del numero di linking dal valore Lk0 in fun-zione della variafun-zione del numero di twist e della variafun-zione del numero di writhe, dai valori T w0 e W r0che si hanno in condizioni standard.

Spesso si tende a identificare il supercoiling con il writhe. Questo non è propriamente esatto, poichè il supercoiling rappresenta l’eccesso di stress tor-sionale posseduto da una molecola di DNA circolare, o da una porzione di DNA le cui estremità sono vincolate a non poter ruotare, ed esso si può ma-nifestare sotto forma di twist e writhe. É anche vero, però, che studi su DNA superavvolto negativamente mostrano che la differenza di linking si distri-buisce approssimativamente nei 3/4 in ∆Wr, e solo 1/4 in ∆Tw. Sembra dun-que che la configurazione più stabile dal punto di vista energetico sia dun-quella in cui il supercoiling negativo si manifesta maggiormente in supereliche piut-tosto che in una diminuzione del passo h dell’elica. Questo è in realtà vero per molecole di DNA sufficientemente lunghe. É possibile ricavare, infatti, una funzione di energia libera per il supercoiling (cfr.Appendice B):

∆Gsc N ⁼ N K h2 σ² = N K ∆T w N ⁺ ∆W r N 2 (1.10) La (1.10) è una energia di tipo elastico con N K/h² costante elasica, con hindipendente da N in quanto dipende solo dalle condizioni ambientali in

10Si ha sempre che |Lkm− Lk0| ≤ 0.5. Per molecole con N sufficientemente grande, questa

(a) (b) (c)

(d) (e)

Figura 1.19. Twisting e writhing in un modello a ’tubo’ del DNA.É possibile modellare il DNA con un tubo, sopra il qua-le disegnamo una linea per tenere traccia della torsione del tubo. In (a) il DNA è ’rilassato’: Lk = Lkm ed è possibile ve-dere interamente la linea. In (b) è mostrato il DNA untwisted: ∆Lk = −4, ∆T w = −4, W r = 0. Infatti, la linea compie 4 giri completi attorno all’asse, ma il non vi sono autointersezioni. In (c) il DNA assume una conformazione ’toroidale’, nel quale l’asse della doppia elica giace su un toro (reale o immagina-rio). In (d) è mostrata una conformazione ’plectonemica’ del DNA superavvolto: ∆Lk = −4, ∆T w ≈ 0, W r ≈ −4; il nume-ro di writhe è appnume-rossimativamente uguale a −nsinγ, dove n è il numero di autointersezioni e γ è l’angolo di’avvolgimento’ della superelica. Nel nostro caso γ ≈ 90o, per cui W r ≈ −n. Tale conformazione non è la più comune. In (e) è mostrata la conformazione plectonemica con minore energia: ∆Lk = −4, ∆T w ≈ −1, W r ≈ −3. É bene notare che nelle due conforma-zioni plectonemiche il maggior contributo all writhing è dato dai loops ’terminali’, a cui è associata una piegatura totale del tubo maggiore di 180o. Immagini tratte da [11].

cui si trova la molecola di DNA. K = K(N ) può essere, in generale, una fun-zione di N [4]. É stato mostrato che il valore di N K è indipendente da N per valori di N superiori a 1000 bp [52,27], per cui K ∼ 1/N . Si può anche vedere, però, che al di sotto di 1000bp non è così. La quantità N K aumenta al diminuire di N , ovvero l’energia libera per unità di lunghezza associata ad una conformazione con supercoiling maggiore (in modulo) aumenta. Questo mostra come, diminuendo progressivamente la lunghezza della molecola di DNA, sia sempre più difficile ottenere una conformazione della molecola di DNA con tale valore di σ. Dalla (1.10) si può vedere che la quantità N K può dipendere dalla variazione unitaria di twist o di writhe. Poichè per un dato overtwist o untwist per unità di lunghezza della doppia elica si deve richiede-re approssimativamente la stessa energia per unita di lunghezza, qualsiasi sia lunghezza della molecola di DNA, si ha che questo aumento della costante N Kè attribuibile al solo writhing. Il writhing è essenzialmente una piegatura dell’asse dell’elica del DNA, è la maggior parte di tale piegatura è localizzata loops terminali, o apical loops, come si vede inFigura 1.19. É per questo che per N piccolo ci si aspetta maggior resistenza al writhing. Sulla base di ciò, Horowitz e Wang [27] ipotizzarono che fosse necessario un ∆Lk di ben 1.5 - 2.0 per indurre un cerchio di DNA di lunghezza minore di 300 bp ad as-sumere una conformazione writhed, mentre per ∆Lk il supercoiling si srebbe manifestato solamente in una conformazione più twisted. Analisi in elettrofo-resi mostrarono effettivamente che per molecole circolari di DNA lunghe 178 bp il supercoiling indotto si manifesta tutto sotto forma di twist, fino a quando due superavvolgimenti causano il cambio della conformazione da circolare alla tipica figura ad otto (un writhe).

Quasi tutto il DNA presente in natura, dai plasmidi dei batteri ai cromo-somi degli eucarioti, esibisce le stesse proprietà topologiche e geometriche finora presentate. Nonostante il numero di linking è definito solo per mole-cole di DNA circolari chiuse come i plasmidi, i cromosomi, soprattutto negli eucarioti, sono formati da loops, delimitati da punti di ancoraggio. I punti di ancoraggio vincolano la rotazione del DNA all’interno di questi loops, o domini di supercoiling, lunghi fino a centinaia di kb. Pertanto, poichè lo stress torsionale non può diffondere oltre i punti di ancoraggio, i domini di super-coiling possono essere considerati come se fossero circolari e chiusi, e, perciò, ciò che è stato detto fino ad ora continua a valere anche per segmenti di DNA eucariotico.