Il tampone col campione raccolto viene inserito in una provetta con una soluzione di eluizione (2 ml) che aiuta a far rilasciare le eventual

sostanze stupefacenti, e la provetta viene chiusa. Per recuperare il fluido salivare, bisogna quindi separare il tampone

ripetutamente il tappo, premere il cotone contro il fondo della provetta con un apposito filtro e raccogliere il fluido. La saliva è così diluita con la soluzione tampone ottenendo un quantitativo totale di 3 ml di soluzione per l’analisi di screening ed eventuali analisi di conferma. La soluzione ottenuta rimane stabile a temperatura ambiente fino a 3 giorni, successivamente deve essere refrigerata. La provetta può essere quindi trasportata al laboratorio analisi senza particolari precauzioni.

3 Quattro gocce della soluzione campione ottenuta (1 ml), vengono versate nel pozzetto di raccolta della cartuccia, dove avviene la reazione antigene- anticorpo. La soluzione scorre per azione

capillare attraverso la finestra e, dopo circa 12 minuti, si procede alla lettura. Il test immunochimico Cozart è basato sulla reazione tra l’antigene eventualmente presente nella soluzione ottenuta, e gli anticorpi antidroga marcati con oro ed immobilizzati all’interno della cartuccia in una specifica sequenza. L’antigene eventualmente presente,

blocca l’anticorpo marcato ed inibisce la reazione colorimetrica. Se nel liquido esaminato non ci sono sostanze stupefacenti appaiono delle righe rosse. Se invece sono presenti delle droghe non appare nessuna banda rossa. La presenza della linea di controllo (contenente anti IgG) indica la

di una linea in corrispondenza dell’anticorpo immobilizzato indica assenza dell’antigene, assenza o riduzione del colore nella posizione dell’anticorpo specifico immobilizzato indica la presenza della droga stessa.

4. A questo punto, la cartuccia viene inserita nello strumento Cozart Rapiscan per la lettura elettronica. Lo strumento legge ed interpreta il contrasto fra le eventuali righe rosse e, di conseguenza, è in grado di determinare la presenza di sostanze stupefacenti. 5. I risultati appaiono sul

video dello strumento e possono essere stampati

Tabella – Analiti e relativi valori cut-off del dispositivo Cozart DDS Detected drug group (target compound) Cut- off / ng/ml Amphetamine 50 Methamphetamine 50 Cocaine (benzoylecgonine) 30 Opiates (morphine) 30 Cannabis (∆9- THC) 31*

Metodica GC/MS

Tutti i campioni risultati positivi ai 2 test consecutivi effettuati su strada con metodica Cozart DDS, sono stati confermati attraverso GC/MS.

Fig. 12 GS/MS modello Varian MS 4000

Il GC/MS utilizzato nel nostro laboratorio è il Varian 4000 a trappola ionica. Questo modello permette la possibilità di scelta tra diverse modalità di ionizzazione per affrontare qualunque applicazione GC/MS sia qualitativa che quantitativa. In questo studio il sistema era configurato in ionizazione interna.

L’utilizzo della GC-MS in ambito tossicologico permette di analizzare molecole quali: sostanze relativamente volatili, termostabili, sostanze d’abuso e metaboliti (con eventuale idrolisi, estrazione in solvente organico e derivatizzazione).

in miscela che possono avere varia provenienza.

Questo viene reso possibile grazie all'abbinamento di due tecniche: una che permette di separare le varie sostanze della miscela, l'altra che rende possibile la loro analisi strutturale. L'abbinamento della gascromatografia e della spettrometria di massa permette appunto di operare in tal senso. Un limite può essere rappresentato dal fatto che nella gascromatografia si opera con una valore di pressione superiore ad una atmosfera, mentre nel caso della spettrometria di massa si lavora in condizioni di alto vuoto. Se si riesce in qualche modo a conciliare queste due condizioni operative, l'abbinamento diventa sicuramente molto proficuo visto che per ambedue le determinazioni le sostanze da analizzare sono nello stato di vapore. L'inserimento di un opportuno setto poroso avrebbe due scopi: quello di separare la sostanza che arriva dal gascromatografo al gas di trasporto; e quello di concentrare la sostanza man mano che arriva dal gascromatografo (Fig. 13).

Figura 13- Meccanismo di separazione e concentrazione

La particolare membrana in grado di operare una tale separazione é di natura siliconica e il carrier da usare per la separazione gascromatografica è costituito da elio, che non attraversa la membrana; l'attraversamento della membrana da parte della sostanza é dovuto alla sua affinità nei confronti della membrana stessa che risulterà pertanto permeabile soltanto alla sostanza e non al gas di trasporto.

Le varie sostanze separate attraverso la gascromatografia vengono portate in condizione di alto vuoto e bombardate dal fascio elettronico nella camera di ionizzazione. La purezza delle sostanze che entrano nello spettrometro di massa viene evidenziata dal relativo cromatogramma (Fig. 14) che viene registrato in parallelo.

Figura 14 - GC-MS Full-Scan: 50 ng/ml - Acido (L) 11-Nor-δ9-THC-9-COOH

Nel caso in cui si avesse una sovrapposizione parziale dei picchi cromatografici, lo strumento di massa registra gli spettri delle frammentazioni delle sostanze presenti nella miscela, allora tramite l'uso di un computer é possibile, conoscendo lo spettro di massa di una delle due sostanze, fare una sottrazione dei singoli picchi ed ottenere soltanto lo spettro della sostanza incognita, che può essere cosi analizzata.

Preparazione del campione:

La preparazione del campione segue procedure differenti a seconda dell’analita d’analizzare.

Il campione di soluzione a disposizione per l’esame di conferma era di 1 ml (considerato che dei 3 ml totali di soluzione 1 ml è stato

consumato per ognuno dei due test in serie su strada). A causa del piccolo volume di soluzione a disposizione, il campione è stato analizzato simultaneamente per anfetamine, metanfetamine, MDA, MDMA, EDDP, cocaina, cocaetilene, cannabidiolo, tetracannabiolo e cannabinolo. A tal fine, la tecnica preparativa utilizzata è stata la microestrazione in fase solida (SPME). SPME è una tecnica abbastanza recente, che ha acquisito popolarità negli ultimi anni grazie alla sua semplicità, velocità e sensibilità.

Il metodo è stato introdotto dal Prof. Janusz Pawliszyn dell’Università di Waterloo in Ontario, Canada.

Vengono utilizzati piccoli segmenti di fibre di silice fusa ricoperte di un opportuno materiale (es. Polidimetilsilossano) sigillati in un sistema “a siringa”.

Con questa tecnica si possono estrarre sostanze volatili o semi-volatili da varie matrici e attraverso il sistema a siringa è possibile iniettarle direttamente nel cromatografo (GC o HPLC).

Non sono necessari solventi. L’estrazione dell’analita e la preconcentrazione avvengono in un unico step.

Siringhe SPME sono commercializzate da varie ditte (quali Supelco, Inc e Varian) e vengono utilizzate per numerosi composti in un’ampia varietà di matrici. La microestrazione in fase solida è un metodo di

introduzione del campione. Questa tecnica si basa sulla ripartizione dell’analita tra il campione (soluzione acquosa o matrici

solide) ed il polimero che riveste la fibra di silice fusa (generalmente lunga 1 cm e con diametro di 100 µm).

La fibra è saldata alla parte terminale di un tubicino sottile di acciaio all’interno del sistema a siringa ed è protetta da un rivestimento anch’esso in acciaio. Lo stantuffo dell’apparecchiatura viene spinto per permettere l’esposizione della fibra al campione, quindi ritratto dopo l’opportuno tempo di campionamento e successivamente rispinto all’interno del sistema di iniezione del gas cromatografo.

Figura 15 – Microestrazione in fase solida, processo di estrazione e desorbimento

La quantità di analita adsorbita dalla fibra dipende: • dallo spessore del polimero di rivestimento • dalla costante di distribuzione dell’analita

Il tempo di estrazione sarà determinato dal tempo richiesto per estrarre gli analiti con la costante di distribuzione (campione/fibra) più elevata.

La costante di distribuzione generalmente aumenta all’aumentare del peso molecolare e dal punto di ebollizione dell’analita.

La selettività può essere variata cambiando il tipo di polimero di rivestimento o lo spessore dello strato di polimero.

In generale, composti volatili vengono meglio estratti con strati più spessi di polimero, mentre rivestimenti con spessori più sottili sono efficacemente impiegati per analiti semivolatili. Considerando un rivestimento polimerico liquido, la quantità di analita adsorbita dal polimero è direttamente proporzionale alla concentrazione di analita nel campione secondo la seguente relazione:

dove:

n = massa di analita adsorbito dal polimero

C0 = concentrazione iniziale di analita nel campione

Kfs = coefficiente di ripartizione per l’analita tra il rivestimento polimerico e il campione

Vf = volume del rivestimento polimerico

Vs = volume del campione

L’equazione mette in evidenza che:

• Esiste una relazione lineare tra la massa dell’analita adsorbito e la sua concentrazione iniziale nel campione.

• Benché i valori di Kfs per analiti organici siano molto elevati, non sono

sufficientemente alti da estrarre quantitativamente l’analita dal campione, quindi la tecnica SPME è un metodo all’equilibrio. Attraverso

• Se Vs >> Ksf Vf, la quantità di analita estratto è indipendente dal

volume del campione stesso. Questo rende la tecnica SPME utilizzabile per misure in situ.

SPME è un processo di equilibrazione multifase.

Gli analiti vengono trasferiti dal campione al rivestimento della fibra durante il tempo di esposizione. L’estrazione può essere considerata quantitativa quando si raggiunge l’equilibrio tra le due fasi; in altre parole quando si raggiunge l’equilibrio, la quantità di analita estratto è costante ed indipendente dal tempo di esposizione.

Principali vantaggi:

- Semplicità: fa di questa tecnica un’efficace alternativa ai metodi di estrazione tradizionali.

- Rapidità: l’equilibrio può essere raggiunto in soli 2-30 minuti (dipende dall’analita).

- Sensibilità: si possono determinare concentrazioni dell’ordine dei ppt.

- Economicità: le fibre sono riutilizzabili (il tempo di vita delle fibre dipende dalle condizioni d’uso. Comunque è stato verificato che in condizioni non troppo drastiche, possono essere riutilizzate per più di 100 iniezioni) e non ci sono costi per solventi.

Le fibre sono disponibili con diverse fasi stazionarie e i rivestimenti hanno spessori variabili da 7 a 100 mm. Il differente spessore permette di assorbire quantità diverse di analita sulla superficie polimerica.

In genere sono costituite da fibre di silice fusa lunghe 1 o 2 cm rivestite con una fase polimerica12. I polimeri più utilizzati sono:

• Polydimethylsiloxane(PDMS) • polydimethylsiloxane/divinylbenzene(PDMS/DVB) • Polyacrylate (PA) • Carbowax/divinylbenzene (CW/DVB) • Polydimethylsiloxane/carboxen (PDMS/CAR) • Polydimethylsiloxane/divinylbenzene/carboxen1006 (PDMS/DVB/CAR) • Carbowax/Templated resin (CW/TPR)

Ad una quantità di 200 µl di campione sono stati addizionati standard interni deuterati analoghi alle sostanze esaminate (ottenute da Radian LLC, Austin, TX, USA).

La tecnica SPME è stata effettuata utilizzando fibra SPME da 30 µm con rivestimento di polidimetilsilossano. Il campionamento è stato processato mediante immersione diretta, ponendo il campione in un insert combo microtube da 300 µl; dopo l'aggiunta di cloruro di sodio e 0,1 M di NaOH per raggiungere pH 8.0, la fibra è stata direttamente

Dopo il campionamento, si è proceduto al desorbimento termico degli analiti direttamente nella porta di iniezione del GC.

Parametri strumentali

La temperatura della colonna è stata mantenuta a 40°C per 3 minuti, poi aumentata di 5 °C fino a 60°C, 10°C fino a 140°C e 20°C fino a raggiungere 280°C. Le temperature della porta di iniezione, della sorgente ionica e della transfer line sono state settate a 280 °C, 220°C e 310°C rispettivamente. Il desorbimento termico è stato ottenuto a 280°C per 3 minuti all’interno del gas cromatografo. L’elio (He) è stato usato come gas carrier con flusso di 1ml/min. Lo spettro di massa è stato ottenuto sulla totalità degli ioni. I composti sono stati identificati mediante il tempo di ritenzione e l’abbondanza relativa degli ioni di conferma. I dati quantitativi sono stati ottenuti in selected ion monitoring (SIM).

Tabella 4.1 – Caratteristiche cromatografiche delle sostanze stupefacenti

Curva di calibrazione

Mediante diluizione della soluzione madre (1µg/ml) in metanolo sono state preparate soluzioni standard a concentrazione nota per ogni sostanza. E’ stata preparata, anche, una soluzione a titolo noto per ciascun analogo deuterato, utilizzato come standard interno. La preparazione dei campioni di saliva da analizzare per la costruzione delle rette di taratura ha previsto, per ciascun punto, l’aggiunta di volumi fissi (5 µl) della soluzione di analita e di standard interno.

La curva di calibrazione è stata ottenuta mescolando 200ml di saliva di controllo con quantità note di analita in metanolo (1 ng/ml, 2ng/ml, 4ng/ml, 10 ng/ml, 20 ng/ml, 50 ng/ml, 75ng/ml, per cocaina e cannabinoidi; 10 ng/ml, 20 ng/ml, 50ng/ml, 75 ng/ml, 100ng/ml per Amfetamina, Metamfetamina, MDA,MDMA, MDE), di standard interno in metanolo (analita deuterato 10 ng/ml), di NaCl 0,1 M e NaOH fino al raggiungimento di pH 8. Sono stati effettuati 3 replicati per ogni valore di concentrazione. Da tali dati è stata ottenuta la curva di calibrazione che correla il rapporto tra le aree dei picchi analita/standard interno con la concentrazione a titolo noto dell’analita. Per ogni analita (Amfetamina, Metamfetamina, MDA, Cocaina, MDMA, MDE, Cannabidiolo, Cannabinolo, THC) è stata ottenuta una curva di calibrazione. La linearità della curva di calibrazione è stata verificata

Il range di concentrazioni delle rette di calibrazione è stato scelto tenendo conto, per ogni sostanza, del proprio valore di cut-off 8.

Fig 15 - Cut-off di conferma in matrice salivare

Le concentrazioni di cannabinoidi rilevabili nella saliva non provengono da processi di ridistribuzione dal compartimento ematico verso quello salivare, quanto piuttosto da fenomeni di sequestro da parte della stessa cavità buccale durante il fumo dello spinello23. Tale ipotesi è peraltro confermata da un altro studio sperimentale in cui è stato dimostrato che la somministrazione endovenosa di cannabinoidi non determina la presenza di THC nella saliva. L’ipotesi che i cannabinoidi non siano in grado di attraversare il compartimento ematico per giungere alle ghiandole salivari trova spiegazione nella natura fortemente lipofila del THC.