Parte A- Ogni soggetto è stato sottoposto ad un prelievo ematico, in condizioni di riposo nella
propria sede abituale, prima dell’inizio dell’AAT, tempo 0, per stabilire un livello basale di riferimento.
I cani co-terapeuti sono stati sottoposti ad un controllo per alcune settimane ad intervalli sempre più distanziati, per un totale di 14 volte; la tabella 4.1 riporta in dettaglio lo schema dei controlli effettuati.
Tabella 4.1 Schema dei controlli, riportati in distanza di tempo dall’inizio dell’AAT in base alle settimane trascorse tra un controllo e l’altro.
Controlli 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Tempo 0 1 Sett. 2 Sett. 3 Sett. 4 Sett. 15 Sett. 26 Sett. 32 Sett. 36 Sett. 50 Sett. 54 Sett. 64 Sett. 68 Sett. 74 Sett.
Il sangue, prelevato immediatamente dopo l’ultima seduta della giornata, è stato posto in provette eparinate, centrifugate immediatamente a 3400g per 4 minuti ed il plasma, in due aliquote, è stato congelato a -18°C. Gli esami sono stati svolti tutti insieme alla fine del periodo di studio.
I cani co-terapeuti sono stati sottoposti ad un controllo per alcune settimane ad intervalli sempre più distanziati.
I prelievi di sangue venivano effettuati, per ogni cane, dopo l’ultima seduta della giornata.
I giorni totali di controlli sono stati 14, nei quali i cani sono stati sottoposti a prelievi di sangue per la determinazione dei parametri ossidativi d-ROMs e BAP.
Parte B- Sono stati eseguiti prelievi di saliva ad ogni cane, per la quantificazione dei soli d-
ROMs, subito prima dell’inizio e subito dopo la fine del ciclo di sedute della giornata, con cadenza quindicinale per un totale di 14 prelievi.
Tabella 4.2 Schema dei controlli, riportati in distanza di tempo dall’inizio dell’AAT in base alle settimane trascorse tra un controllo e l’altro.
Controlli 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Tempo 0 1 Sett. 3 Sett. 5 Sett. 7 Sett. 9 Sett. 11 Sett. 13 Sett. 15 Sett. 17 Sett. 19 Sett. 21 Sett. 23 Sett. 25 Sett.
In seguito ai risultati ottenuti nella prima parte dello studio, ovvero un mantenimento stabile dello stato ossidante, trattandosi di animali sani, correttamente alimentati e attentamente gestiti, i BAP non sono stati determinati in questa fase dello studio.
I controlli sono stati mirati sempre alla ricerca dei parametri ossidativi ma utilizzando come substrato la saliva al posto del sangue. La saliva è stata raccolta dai conduttori tramite metodo Salivette® (SARSTEDT, Etten-Leur, Netherlands), centrifugata immediatamente a 4000g per 10 minuti e congelata.
Il prelievo è stato effettuato prima dell’inizio e alla fine di ogni giornata di sedute.
4.4 ESAMI DI LABORATORIO
Su ciascun campione di sangue, per la contestuale valutazione del sistema ossidante e di quello antiossidante, sono stati eseguiti i test d-ROMs (Reactive Oxygen Metabolites - derivative compounds) e BAP (Biological Antioxidant Potential) (Diacron International, Grosseto,It) con lo spettrofotometro Slim (SEAC, Calenzano, It). I metodi utilizzati sono validati nella specie canina. (Pasquini et al.,2008)
Le unità di misura del test d-ROMs sono espresse in U. CARR, dalle iniziali del cognome del chimico pientino, Mauro CARRATELLI, inventore del d-ROMs test. Una U CARR equivale a 0.08 mg/dL di una soluzione di perossido di idrogeno.
Per la specie canina l’intervallo di riferimento è da 56,4 a 91,4 U CARR, inferiore di circa un terzo rispetto a quello decretato per la specie umana (250-300 U CARR) (Pasquini et al.,2008). Questa differenza potrebbe essere dovuta al fatto che il cane, contrariamente all’uomo, ha la capacità di produrre acido ascorbico, vitamina C, potente antiossidante, sintetizzato nel fegato. (Iorio,2003)
I risultati del BAP test vengono invece espressi in micromoli di ferro ridotto per L di campione esaminato (mmol/L) e per la specie canina è stato trovato un intervallo di riferimento che si
avvicina molto a quello individuato per la specie umana ossia 1440–3260 mmol/L. (Pasquini et
al.,2008)
4.5 ANALISI STATISTICHE
Parte A- I dati ottenuti per entrambi i parametri indagati, raggruppati per momento di
campionamento, sono stati analizzati, dopo aver verificato la distribuzione normale, tramite test ANOVA e per P<0.05 con il test Bonferroni.
Il test t-Student è stato applicato ai dati suddivisi in base al tipo di patologia dei pazienti in terapia. Sono considerate significative le differenze per P<0.05.
Parte B- I dati sono stati analizzati tramite ANOVA a una via per evidenziare eventuali
differenze tra i diversi soggetti e tra i valori precedenti e successivi le sedute. L’ipotesi nulla è stata rifiutata per P<0.05.
Capitolo 5
Risultati
Parte A
La tabella 5.1 riporta i valori di d-ROMs e BAP raggruppati in base al giorno di controllo in modo da individuare le variazioni in base al tempo: i d-ROMs risultano più elevati nelle settimane 15, 32 e 64 in particolare rispetto agli altri giorni di controllo.(P<0,05).
Tabella 5.1 Valori di d-ROMs e BAP relativi ai giorni di controllo
Le lettere in apice evidenziano le differenze tra i gruppi secondo il Multiple Range Test Tukey (p<0.01) N: Numero di soggetti M: media SEM:Errore Medio Standard AR: Average Rank
d-ROMs
U.CARR
BAP
mmol/L
Controlli N M SEM AR N M SEM AR
T0 4 71.0a 9.9 11.25 4 2236 146 27.5 SETT. 1 4 111.1ab 9.9 36.6 4 2280 146 12.6 SETT 2 4 109.5ab 9.9 36.7 4 2162 146 18.8 SETT. 3 4 99.7ab 9.9 30.5 4 2302 146 28.5 SETT. 4 4 71.3a 9.9 12.5 4 2306 146 27.8 SETT. 15 4 132.4b 9.9 46.4 4 2148 146 18.6 SETT. 26 4 84.6ab 9.9 22.0 4 2506 146 38.7 SETT. 32 4 137.3b 9.9 49.0 4 2696 146 48.0 SETT. 36 4 67.7a 9.9 7.25 4 2521 146 36.8 SETT. 50 4 100.8ab 9.9 31.2 4 2092 146 17.7 SETT. 54 4 92.7ab 9.9 25.6 4 2425 146 36.5 SETT. 64 4 121.7b 9.9 41.2 4 2105 146 15.6 SETT. 68 4 87.2ab 9.9 21.0 4 2338 146 36.2 SETT. 74 4 91.9ab 9.9 25.8 4 2333 146 33.2
Il grafico sottostante mette in evidenza la differenza di andamento nel tempo di d-ROMs e BAP; infatti mentre i primi mostrano dei picchi in determinati giorni, il BAP ha un andamento più costante e uniforme delineando un certo mantenimento della capacità antiossidante nel tempo.
Figura 5.1 Andamento di d-ROMs in UCARR e BAP in mmoli/L relativi alle settimane di controllo.
Parte B
Preliminarmente è stato necessario procedere alle operazioni di validazione del metodo. Risultati della validazione della determinazione salivare dei d-ROMs nel cane
Accuratezza
Il valore di r è risultato pari a 0,88 indicando una forte correlazione positiva tra valori plasmatici e salivari e confermando quindi una buona accuratezza del metodo.
Precisione
Per la precisione intrasaggio, poiché il valore medio del CV è risultato inferiore a 10 %, 7,8% in particolare, il metodo può essere considerato sufficientemente preciso.
Anche per quanto riguarda la precisione intersaggio è stato ottenuto un CV di 5,8% che va a confermare la precisione del test.
0,00 20,00 40,00 60,00 80,00 100,00 120,00 140,00 160,00 0,00 500,00 1000,00 1500,00 2000,00 2500,00 3000,00 U .C A R R m m o l/ L BAP d-ROMs
Linearità
Tra i valori ottenuti e i fattori di diluizione è stato calcolato il coefficiente r, risultato pari a 0,99, evidenziando un’ottima linearità della metodica.
Sono stati quindi calcolati valori di riferimento: 80,438,3; max118,7 min 42,1 U.CARR
Tabella 5.2: valori di d-ROMs salivare di ogni prelievo misurati in U.CARR prima e dopo le sedute di AAT in base alle settimane trascorse tra un controllo e l’altro.
Data Orfeo Nuvola
Prima Dopo Prima Dopo
U.CARR U.CARR U.CARR U.CARR
T 0 56 78 82 57 SETT. 1 91 48 108 124 SETT. 3 66 46 39 49 SETT. 5 44 47 98 123 SETT. 7 74 96 56 93 SETT. 9 59 41 139 65 SETT. 11 59 49 176 49 SETT. 13 54 76 59 47 SETT. 15 77 88 100 36 SETT. 17 39 64 127 46 SETT. 19 89 48 120 42 SETT. 21 89 44 102 68 SETT. 23 48 50 92 77 SETT. 25 66 50 89 40
I valori sono tutti all’interno del range di riferimento ad eccezione di una lieve variazione oltre il valore massimo in 5 prelievi di Nuvola, 3 prima e 2 dopo le sedute.
Sono emerse differenze (P<0,01) tra i valori di Nuvola prima dell’inizio delle sedute rispetto a quelli di Nuvola alla fine delle stesse ed anche rispetto ai valori di Orfeo, che sono rimasti più omogenei in tutti i prelievi.
In particolare nella Labrador Nuvola si è notato un aumento di d-ROMs rispetto all’intervallo di riferimento, prima delle sedute, nelle settimane 9, 11 e 17 in cui i valori erano rispettivamente 139, 176, 127 U.CARR. Dopo i valori si sono abbassati e sono rientrati nel range.
I giorni in cui i valori sono stati più elevati al termine delle sedute rispetto all’inizio e rispetto all’intervallo di riferimento invece sono stati la settimana 1 e la 5. In questi giorni i valori riportati sono stati 124 e 123 U.CARR rispettivamente.
Figura 5.2 Andamento di d-ROMs in U.CARR prima e dopo la seduta nel soggetto Nuvola
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 U .C A R R Dopo Prima
Capitolo 6
Discussione
Nell’uomo uno stress psicologico acuto provoca un’alterazione dei livelli ormonali (catecolamine, prolattina, cortisolo), del subset linfocitario e della produzione di radicali liberi ROS (Atanackovic et al.,2002) e lo stress cronico provoca una sovrapproduzione di ossidanti ed una riduzione di antiossidanti endogeni come la superossidodismutasi (SOD) e la catalasi (CAT) in patologie stress-indotte (Zafir et al.,2008; Lucca et al.,2009).
Queste evidenze hanno indotto a introdurre nuovi parametri potenziali indicatori di uno stato di affaticamento.
Il potenziale vantaggio della determinazione dello stato ossidativo, nella valutazione dello stress, rispetto a parametri tradizionali più comunemente usati tra cui il cortisolo plasmatico o salivare, è il riconoscimento di una situazione di reale rischio organico poiché è ben noto come lo stress ossidativo sia coinvolto nella patogenesi e nella progressione di numerosi stati patologici infiammatori, degenerativi e neoplastici (Sechi,2017).
Riguardo alle varie modalità di valutazione di uno stato di stress psico-fisico, ricerche hanno infatti dimostrato come parametri fisiologici di valutazione più utilizzati come cortisolo plasmatico, salivare o urinario, non siano specifici e, probabilmente non riflettano uno stato emotivo (Taylor e Mills,2006).
Inoltre, è riportato in letteratura, come spesso non sia verificabile una correlazione tra valori di cortisolo, risposta fisiologica allo stress, e parametri comportamentali relativi alla valutazione di stress (Rooney,2007).
Uno dei motivi della discordanza tra parametri fisiologici e comportamentali spesso riportata in letteratura (Hiby et al.,2006; Hennessy,2001; Beerda1999) potrebbe essere rappresentato dal
fatto che il cortisolo, specialmente plasmatico, è estremamente dipendente dal contesto temporale, motivo per il quale viene utilizzato come indice di stress acuto (Hennessy,2013).
Da ricordare inoltre come lo stress cronico possa deregolare l’intero sistema ipotalamo-ipofisi- surrene responsabile anche della produzione di cortisolo dando cosi’ origine a dei risultati discordanti (Korte,2001).
In passato era stato proposto anche di poter valutare il benessere animale attraverso l’analisi del leucogramma individuale, comparando i livelli di leucociti con quelli di cortisolo plasmatico. I globuli bianchi infatti possono potenzialmente fornire preziose informazioni sulle risposte fisiologiche e patologiche dell’organismo a diversi stimoli (Jain,1986).
La valutazione di uno stato di stress psico-fisico attraverso l’utilizzo di questi parametri però non è mai stato approfondito poiché richiedeva indagini fin troppo approfondite (Part,2014).
Inoltre lo studio di parametri comportamentali, seppur ben delineati e valutati, potrebbe sempre risentire ed essere influenzato da una valutazione soggettiva (Beerda,1997).
Neanche variazioni del comportamento, per quanto sempre più studiati e affinati nella valutazione di uno stato di sofferenza psico-fisica, riescono a riflettere sempre in modo univoco lo stato di stress fisiologico (Hennessy,2013).
Spesso infatti, proprietari o conduttori dei cani, sono in grado di rilevare dei cambiamenti di atteggiamento o comportamento del proprio animale ma potrebbero non riuscire a distinguere se si tratta di stress o di eccitazione positiva oppure potrebbero confondere la vera causa di determinate stereotipie. Ad esempio, l’autogrooming (in etologia il comportamento di pulizia del mantello o della pelle) è un classico atteggiamento indice di stress ma potrebbe essere confuso con una contaminazione ambientale o viceversa; in questo modo la valutazione viene cosi’ alterata.
Per questo dovrebbe essere sempre indispensabile l’intervento di un veterinario comportamentali sta che abbia le competenze per leggere in modo corretto i segnali del corpo del cane (Mariti,2015).
Quindi, se da un lato la valutazione del benessere attraverso lo studio del comportamento è sicuramente immediata e indice di un precoce stato di stress, è sempre opportuno affiancare a questo tipo di valutazione anche lo studio di altri parametri tra i quali: cortisolo, salivare o plasmatico, frequenza cardiaca e respiratoria (Glank,2017).
Inoltre, data la grande variabilità individuale dei segnali comportamentali di stress del cane e il fatto che questi siano ritenuti poco patognomonici, la durata di certi comportamenti potrebbe risultare molto più importante della frequenza con la quale questi si manifestano.
Individuare una risposta ad uno stressor è importante ma, determinare il tempo di recupero lo è ancora di più per l’impatto sul benessere del cane.
Uno stato di scarso benessere infatti è accettabile se di breve durata, se l’animale è in grado di tollerare o se recupera velocemente mentre uno stress prolungato può essere altamente dannoso (Mariti,2015).
Esistono testimonianze che mostrano come lo stress psicologico rappresenti una delle più importanti ragioni di progressione di patologie correlate allo stress ossidativo (Manuck,1986 ; Carney,2002).
Diversi sono infatti gli studi scientifici effettuati su umani e animali che dimostrano la presenza di un elevato stress ossidativo in condizioni di stress psicologico (Nakhaee,2013).
Sono state condotte ricerche, prima nel ratto e poi nell’uomo, che evidenziano come agenti di stress sia fisici che psicologici, non solo agiscono sull’asse ipotalamo-ipofisi-surrene, ma sono anche causa di danni ossidativi dovuti ad uno squilibrio tra le componenti pro-ossidante e antiossidante (Zafir et al.,2009; Goncalves et al.,2008).
La valutazione del benessere tramite lo studio dei parametri ossidativi, d-ROMs e Potenziale antiossidante BAP in questo specifico caso, offre la possibilità di prendere in esame un altro
aspetto legato a condizioni di stress mettendo in risalto una eventuale condizione di reale sofferenza dell’organismo, essendo noto come lo stress ossidativo sia implicato in numerosi processi patologici e danni tissutali, e come sia correlato con uno stato di stress psico-fisico (Colaianna,2013; Cafazzo,2014; Sechi,2017; Ghezzi,2017).
I risultati ottenuti dal primo studio, basati sulla quantificazione di d-ROMs e BAP nel sangue, seppure preliminari, introducono una nuova possibilità di utilizzo del monitoraggio dello stato ossidativo come indicatore di stress.
Un vantaggio nella scelta di impiegare i parametri ossidativi attraverso l’utilizzo di uno strumento come lo spettrofotometro, è rappresentato sicuramente dalla semplicità del metodo e dai costi contenuti rispetto ad altri metodi di indagine.
I valori medi di d-ROMs mostrano significative variazioni nel tempo; in particolare si osservano valori elevati nei giorni preceduti da un periodo di riposo di circa 30 giorni.
In particolare si osservano valori elevati di d-ROMs subito dopo la prima seduta, corrispondente alla settimana 1, (111.1 U.CARR.) ma dopo la seconda e la terza settimana il valore medio tende ad abbassarsi, pur rimanendo leggermente al di sopra dell’intervallo di riferimento (56-91 U.CARR.)
Questi risultati farebbero ipotizzare un graduale adattamento dei cani alla situazione di seduta terapeutica.
Il valore tende invece a risalire in corrispondenza dei controlli effettuati nei giorni preceduti da un periodo di riposo come nel caso del 6° e 8° giorno di prelievo, corrispondenti alle settimane 15 e 32, dove si osservano i valori medi di d-ROMs più elevati in assoluto, rispettivamente 132,4 e 137,3 U.CARR.
I giorni di prelievo riportati si riferiscono rispettivamente al momento della ripresa del lavoro subito dopo le vacanze estive e le vacanze Natalizie, periodo in cui i cani sono stati a riposo ed esonerati da ogni tipo di AAT.
Poiché ogni cane svolge, secondo protocollo, tutte le sedute con gli stessi bambini, l’andamento riscontrato, può far supporre un adattamento degli animali all’attività, ovvero una continuità del lavoro nel tempo sembra avere un’influenza positiva.
Per quanto riguarda il BAP non sono emerse differenze significative e i valori medi hanno avuto un andamento piuttosto omogeneo e uniforme, non allontanandosi mai troppo dall’intervallo di riferimento individuato per la specie canina: 1440–3260 mmol/L; il mantenimento di un’adeguata capacità antiossidante può essere attribuita alle buone condizioni sanitarie nonché ad un’alimentazione completa e bilanciata dei cani e ad una corretta gestione dei soggetti.
Relativamente al secondo progetto è in primo luogo opportuno sottolineare l’importanza della validazione del metodo d-ROMs su campioni salivari di cane. Poiché questo parametro viene riconosciuto come importante indicatore di variazioni del sistema ossidativo anche in seguito a stress ambientali di vario genere, poter eseguire il test con procedure minimamente invasive garantendo la stessa validità dei risultati apre la possibilità ad ampie applicazioni, sia in ambito clinico che comportamentale.
In seguito alla riuscita validazione del metodo, e alla letteratura veterinaria sull’argomento “parametri ossidativi come indici di stress” (Cafazzo et al.,2014; Fazio et al.,2014; Passantino et
al.,2014; Sechi,2016), è stato ritenuto opportuno affidarsi ai soli d-ROMs salivari per la
valutazione dello stato ossidativo dei due cani co-terapeuti.
Il test spettrofotometrico, d-ROMs infatti è in grado di evidenziare la potenziale presenza di idroperossidi nel substrato in esame e quindi, contrariamente a quanto avviene per i test più diffusi che determinano la concentrazione dei prodotti finali dell’ossidazione, può precocemente
lo rende idoneo anche come test di screening per la valutazione del benessere dell’animale (Sechi,2017).
Per quanto riguarda la valutazione della capacità antiossidante totale, essa sembra essere più significativa nel valutare lo stress cronico, dal momento che è influenzata dalla componente endogena ed esogena che rimane facilmente costante in cani sani e adeguatamente alimentati. Viceversa, nello stress acuto si assiste ad una maggiore produzione di specie reattive dell’ossigeno.
Per questi motivi, unitamente ai risultati ottenuti nella prima fase, nella fase B dello studio si è scelto di valutare i soli d-ROMs.
In questo caso sono emerse differenze tra i due cani co-terapeuti essendo i valori del primo, il maschio Orfeo, assolutamente omogenei e non uscendo mai dall’intervallo di riferimento per la specie canina: 42-118 U.CARR sia prima che dopo lo svolgimento delle sedute mentre, nel secondo soggetto, nella Labrador Nuvola, si assiste all’innalzamento dei d-ROMs in alcuni campioni, prevalentemente prima dell’inizio dell’attività.
In particolare i valori di Nuvola prima dell’inizio dell’AAT mostrano una differenza significativa (P<0,01) rispetto a tutti gli altri.
I valori elevati si trovano comunque, nella maggior parte dei casi, all’interno dell’intervallo di riferimento; solo alcuni risultano lievemente oltre il limite superiore del range.
Anche in questi casi, dopo le sedute i valori sono scesi e sono rientrati nell’intervallo di riferimento.
I valori elevati prima dell’inizio del lavoro possono essere interpretati come una percezione soggettiva di stress da parte dell’animale le cui cause possono essere attribuite sia al viaggio che precedeva l’inizio delle sedute (Fazio et al.,2014) sia ad una fase preparatoria al lavoro da svolgere, caratterizzata da ansia e/o eccitazione.
I cani infatti provenivano da un viaggio della durata di circa un’ora e in letteratura è noto come gabbie di contenimento, veicolo di trasporto, il rumore e la temperatura ambientale siano identificati come fattori stressanti legati al trasporto (Ferreira et al.,2014).
Sedute di AAT di questa titpologia e durata non sembrano determinare condizioni stressanti rimanendo i d-ROMs invariati nel caso di valori ridotti prima dell’inizio del lavoro e riducendosi nel caso in cui fossero elevati prima della seduta.
I risultati ottenuti possono indirizzare verso una sorta di adeguamento dei cani al tipo di lavoro richiesto nel tempo, facendo escludere un’azione stressante delle sedute sui cani, anzi addirittura ipotizzare un effetto positivo sul loro benessere.
Conclusioni
Partendo dal presupposto che questo è uno studio pilota, svolto con un ridotto numero di soggetti, sono emersi interessanti spunti che meriterebbero di essere approfonditi per ciò che riguarda i metodi di valutazione del benessere del cane attraverso lo studio dei parametri ossidativi, in progetti di AAT e in altri contesti.
Dai risultati ottenuti possiamo affermare che le sedute di AAT non hanno provocato nei cani evidenti segnali di stress.
Cadenza, intervalli, pazienti e modalità utilizzate sono risultate infatti congrue al mantenimento del benessere dei cani co-terapeuti.
I risultati emersi dalla valutazione dello stato ossidativo non hanno evidenziato situazioni particolarmente stressanti anzi, hanno fatto ipotizzare un’azione rilassante delle sedute dato l’andamento dei d-ROMs che spesso, in caso di valori elevati prima, dopo la seduta tendono a diminuire notevolmente.
Lo studio ha messo in evidenza il possibile utilizzo del d-ROMs test come marker precoce di stress, ad integrazione delle altre consolidate indagini come cortisolo e manifestazioni comportamentali e i risultati ottenuti sono da considerarsi incoraggianti e meritevoli di ulteriori approfondimenti, rendendo auspicabili altre ricerche al fine di poter consolidare i dati ottenuti con un aumento della casistica e con tempi di studio più lunghi.
Per quanto riguarda la determinazione del cortisolo, malgrado sia stato negli ultimi anni uno dei parametri più diffusi per la valutazione del benessere animale e canino, la sua validità nell’individuare una condizione di distress rimane ad oggi oggetto di discussione; come sottolinea Hennessy i risultati relativi al cortisolo, sia ematico che salivare, vanno sempre esaminati con cautela prima di tutto perché il cortisolo è soltanto uno degli elementi del
complesso sistema dello stress e, secondariamente perché è particolarmente utile nel valutare lo stress acuto.(Hennessy,2013)
Il test spettrofotometrico d-ROMs che è in grado di evidenziare la potenziale presenza di idroperossidi nel substrato in esame può precocemente riconoscere una condizione di stress ossidativo; questa caratteristica predittiva lo rende idoneo anche come test di screening per la valutazione del benessere dell’animale e il riconoscimento di uno stato di stress mettendo in evidenza una reale sofferenza dell’organismo.
Insieme al d-ROMs test è comuque sempre importante misurare anche la capacità antiossidante dell’organismo con test come il BAP per avere una valutazione complessiva sul grado di stress