CELLULE PRIMARIE NUOVO MODELLO SPERIMENTALE PER LA VALUTAZIONE DI NEFROTOSSICITÀ INDOTTA DA FARMACI.

Il costo impressionante per portare un farmaco sul mercato, unito all’elevato tasso di fallimenti dei potenziali composti, a causa dell’inaspettata tossicità per l’uomo nelle prime fase cliniche, rendono indispensabile lo sviluppo di modelli per meglio predire la tossicità dei farmaci più rilevanti per l’essere umano. La nefrotossicità indotta dai farmaci rimane particolarmente difficile da predire sia nelle fasi pre-cliniche che in quelle cliniche e passa spesso inosservata finché il paziente non dev’essere ricoverato. Si stima che ci vogliano 9 anni e costi tra gli 0.8 e 1.7 miliardi di dollari per portare un farmaco attraverso i trial clinici, e che circa l’8% dei farmaci che entrano nella fase I raggiungeranno poi il mercato. Questo basso tasso è causato da diversi fattori, tra i quali la mancanza di metodi ben consolidati in grado di prevedere con precisione l’utilità clinica e la tossicità dei farmaci durante lo sviluppo pre-clinico. Attualmente gran parte degli studi di tossicità indotta da farmaci si basano su

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68 esperimenti su modelli animali quali ad esempio i roditori. I modelli animali offrono il vantaggio di un sistema complesso tuttavia, la biologia animale differisce per mo lti aspetti da quella umana a causa delle differenze fisiologiche ed ambientali, rendendoli così in grado di prevedere le risposte umane solo in una certa misura. Oltretutto i test su, ad esempio, i roditori, vengono effettuati un gran numero di volte e con animali altamente ordinati con gli stessi background genetici, età, fattori ambientali e stati di malattia. Inoltre solo il 50% della tossicità in roditori è predittiva di tossicità nell’uomo.Queste condizioni non possono venir riprodotte e controllate nell’uomo, soprattutto nelle prime fasi cliniche. A questo va aggiunto che nel caso di nefrotossicità indotta da farmaci, le persone più sensibili sono quelle con condizioni renali insufficienti o quelle già in trattamento con farmaci nefrotossici. Queste persone non vengono normalmente incluse negli studi clinici e così la loro risposta si saprà solo quando verranno trattati con un farmaco approvato.

Per tutti questi motivi risulta sempre più importante sviluppare nuovi modelli sperimentali, lo scopo di questa tesi infatti è quello di proporre le colture primarie di rene come modello per la valutazione della tossicità indotta da farmaci, grazie alla quantificazione di biomarcatori di tossicità renale quali in particolare l’osteopontina e KIM-1, valutazione di cambiamenti in eventi cellulari quali apoptosi, necrosi e proliferazione a seguito della somministrazione del farmaco e identificazione dei danni indotti a livello di organelli cellulari come ad esempio mitocondri e i lisosomi. Le colture cellulari derivano direttamente dal tessuto animale o umano; le cellule isolate da un qualsiasi tessuto sono in grado di compiere un numero finito di divisioni cellulari in vitro, dopodiché vanno incontro a degenerazione e morte. Tale fenomeno avviene indipendentemente dalla presenza di metaboliti appropriati per la crescita e si indica come senescenza. Le applicazioni delle cellule primarie sono svariate e comprendono: studi di fenomeni legati alla crescita, differenziamento e morte cellulare, studi genetici, studio dei meccanismi cellulari/molecolari coinvolti nelle funzioni cellulari, strumenti per la biologia

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69 molecolare (amplificazione genica, produzione o estrazione di proteine), test di tossicità e strumenti per la terapia (terapia genica, cellule staminali, terapia cellulare).

In questo lavoro di tesi in particolare sono state utilizzate cellule corticali di rene ottenute da topo, ratto e uomo, le cellule prossimali e distali sono state isolate ottenendo così una popolazione eterogenea.

I vantaggi nell’utilizzo di questa metodica per studi tossicologici sono svariati :  Riduzione notevole della sperimentazione animale

 Standardizzazione facile del protocollo  Elevata riproducibilità

 Larga disponibilità di tipi cellulari

 Controllo della variabili ambientali quali ad esempio pH e temperatura  Semplicità d’uso e costi limitati

 Possibilità di valutare in breve tempo gli effetti di un numero considerevole di molecole

 Monitoraggio della tossicità in una cellula molto vicina allo stato in vivo  Tossicita’ in uomo e possibilita’ di valutare le varie tossicita’ tra specie.

Lo svantaggio nell’utilizzo di questo modello sperimentale però sta nel fatto che spesso non si può fare a meno di valutare l’effetto della molecola su un modello sperimentale in vivo, poiché molecole fortemente attive in vitro possono poi risultare molto meno attive o addirittura inattive in vivo. La necessità di passare dalle colture cellulari a un sistema più complesso è legata ai limiti intrinsechi degli studi farmacologici in vitro. Infatti, l’attività di un farmaco è funzione di diversi parametri di cui non si tiene conto in un sistema cellulare, quali l’assorbimento, ladistribuzione, le concentrazioni ottenibili nell’organo e nella cellula bersaglio, il metabolismo e l’escrezione. In generale, le colture cellulari sono sistemi statici in cui spesso la concentrazione intra ed extracellulare della molecola in esame non varia

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70 significativamente nel corso del periodo di osservazione; è quindi del tutto possibile che le concentrazioni e i tempi di esposizione ai quali un’attività farmacologica è osservabile non abbiano grande relazione con la situazione in vivo.

Nonostante questo svantaggio, ovvero la necessità di confermare i risultati ottenuti in vitro anche su modelli in vivo, le colture cellulari rappresentano uno strumento importante per lo screening preliminare di numerose molecole farmacologiche, la loro semplicità e riproducibilità permettono infatti di poter analizzare meccanismi sia cellulari che molecolari, e di ridurre al minimo la sperimentazione animale [115].

Diversi lavori hanno dimostrato come le cellule primarie di rene umano rappresentino un valido modello per lo studio dei meccanismi di trasporto e di regolazione di diversi composti xenobiotici, valutando ad esempio l’espressione di trasportatori di membrana e il meccanismo con il quale i composti xenobiotici causano nefrotossicità [116].

Alla luce dei risultati ottenuti in letteratura, quindi, lo scopo di questa tesi è quello di utilizzare tale modello sperimentale per la valutazione e la quantificazione della nefrotossicità indotta da farmaci grazie allo studio di biomarcatori di danno renale precoce.

Capitolo 2