INIBIZIONE DEL TRASPORTO DI TEA NELLA PROTEINA WT DA PARTE DI MERCURIALI E METALLI PESANT

In questa seconda parte del mio lavoro di tesi è stato investigato l’effetto dei composti mercuriali sul trasportatore umano di cationi organici OCTN1 ricostituito in liposomi. L’attività di trasporto è stata misurata come uptake di [14

C]TEA in proteoliposomi in presenza di MeHg, HgCl2 e CdCl2 aggiunti all’esterno. L’effetto dei composti mercuriali e dei metalli

pesanti sul trasportatore OCTN1 è stato valutato in esperimenti di time course. L’aggiunta di HgCl2 e MeHg 12 µM e CdCl2 46 µM inibisce fortemente il trasporto di TEA da parte di

OCTN1. Dopo 15 minuti, infatti tutti e tre i composti inibiscono il trasporto di più del 50 %. Per verificare se l’inibizione del trasporto è causata dalla formazione di legami covalenti dei composti mercuriali con il trasportatore, l’attività residua di trasporto è stata calcolata dopo l’incubazione dei proteoliposomi con MeHg, HgCl2 e CdCl2, e la successiva rimozione

dell’eccesso di reagenti che non hanno reagito con la proteina. Per raggiungere tale obiettivo i proteoliposomi sono stati incubati con i tre reagenti dei gruppi sulfidrilici e passati attraverso una colonna cromatografica contenente la resina Sephadex G-75 per rimuovere la porzione di molecole che non ha interagito con la proteina di membrana. A seguito di questa procedura l’attività di trasporto è stata valutata come descritto in Materiali e Metodi (2.12), quello che si è visto è che l’aggiunta di HgCl212 µM (figura 8A) , MeHg 12 µM (figura 8B) e CdCl2 46

Risultati

119 stata infatti registrata una inibizione del trasporto pari al 44% nel caso di MeHg , 40% per quanto riguarda HgCl2 e 39% nel caso del CdCl2. Dopo 90 minuti il trasporto risulta

ulteriormente inibito fino a valori pari a 63% , 54% e 50% in presenza rispettivamente di HgCl2, MeHg e CdCl2. I dati sperimentali riportati in figura 8 sono stati interpolati con

un’equazione di velocità di primo ordine. Per valutare se i residui di Cys sono coinvolti nel meccanismo di inibizione da parte dei reagenti mercuriali e dei metalli pesanti, è stato testato l’effetto del DTE, agente riducente dei ponti disolfuro.

L’aggiunta di DTE 2 mM ai proteoliposomi dopo incubazione con i reagenti dei gruppi sulfidrilici causa un ripristino totale dell’attività di trasporto (Figura 8 A,B,C ). Il DTE quindi è in grado di rompere i legami covalenti che si vanno a creare fra tali reagenti e il trasportatore hOCTN1. Infatti, dopo 30 minuti dall’inizio del trasporto, l’aggiunta del DTE alle prove precedentemente incubate con HgCl2, MeHg e CdCl2, causa un ripristino totale del

trasporto. La capacità del DTE di invertire l’effetto di HgCl2 , MeHg e CdCl2, quindi,

Risultati

120 Figura 8: Effetto di HgCl2, MeHg e CdCl2 sull’antiport di TEA mediato dal trasportatore hOCTN1

ricostituito: i proteoliposomi sono stati preincubati o meno con i reagenti per due minuti e passati attraverso una colonna Sephadex G-75. Il trasporto è stato misurato come descritto in Materiali e Metodi aggiungendo 14C-TEA 10 µM a tempo zero all’esterno dei proteoliposomi precedentemente incubati in assenza (○) o in presenza di HgCl2 18 µM (A), MeHg 18 µM (B) e CdCl2 46 µM (●). In □ è stato aggiunto DTE 2 mM, 30 minuti dopo

l’inizio del trasporto in proteoliposomi in presenza di HgCl2 (A), MeHg (B) e CdCl2 (C). Il trasporto è stato

inibito ai tempi indicati come descritto in Materiali e Metodi. I valori rappresentano la media e deviazione standard di tre esperimenti indipendenti.

Risultati

121 Oltre ai reagenti mercuriali e a metalli pesanti sono stati studiati gli effetti di reagenti chimici di cui è nota in letteratura la capacità di interagire con i gruppi SH delle proteine di membrana formando ponti disolfuro misti, i composti MTS (methanethiosulfonate).

In particolare sono stati testai MTSEA, MTSES e MTSEA, fra cui il più efficace è risultato essere MTSEA. MTSEA (methyl thiosulfonate ethylammonium) è uno dei composti maggiormente usati per la valutazione dell’accessibilità di diversi reagenti a residui di cisteina e per l’ identificazione di porzioni della proteina funzionalmente o strutturalmente importanti, questo composto infatti è in grado di legarsi alla catena laterale neutra di un residuo di cisteina caricandolo positivamente e rendendolo strutturalemnte simile a un residuo di lisina. Gli esperimenti condotti su MTSEA hanno evidenziato un andamento del tutto simile a quello dei metalli pesanti e dei composti tossici.

Infatti l’aggiunta di MTSEA 164 μM inibisce fortemente il trasporto di [14

C]TEA, dopo 10 minuti è stata infatti registrata una inibizione pari al 30% mentre dopo 90 minuti di trasporto l’inibizione risulta pari al 46%. L’aggiunta di DTE 2 mM ai proteoliposomi dopo incubazione con MTSEA causa un ripristino totale dell’attività di trasporto (Fig. 9). I dati ottenuti con MTSEA hanno permesso quindi di confermare l’interazione di questi composti tossici con i gruppi SH della proteina.

Risultati

122 Figura 9: Effetto di MTSEA sull’antiport di TEA mediato dal trasportatore hOCTN1 ricostituito: i proteoliposomi sono stati preincubati o meno con MTSEA per due minuti e passati attraverso una colonna Sephadex G-75. Il trasporto è stato misurato come descritto in Materiali e Metodi aggiungendo 14C-TEA 0,1 mM a tempo zero all’esterno dei proteoliposomi in assenza (○) o in presenza di MTSEA 164 µM (●). In □ è stato aggiunto DTE 2 mM, 30 minuti dopo l’inizio del trasporto in proteoliposomi in presenza di MTSEA.Il trasporto è stato inibito ai tempi indicati come descritto in Materiali e Metodi. I valori rappresentano la media e deviazione standard di tre esperimenti indipendenti.

Successivamente è stata valutata la capacità di agenti antiossidanti non tossici, quali la Cisteina (Cys), N-acetilcisteina (NAC) e S-carbossimetilcisteina (CMC), di invertire l’inibizione da parte dei reagenti mercuriali e dei metalli pesanti (figura 10). In questi esperimenti i reagenti dei gruppi sulfidrilici sono stati aggiunti a concentrazioni tali da causare il 50% di inibizione di trasporto di TEA da parte di OCTN1, rispettivamente 18 µM per HgCl2 e MeHg e 60 µM per il CdCl2. Come mostrato in figura 10 la percentuale di attività

residua di trasporto è uguale sia nel controllo (senza aggiunta di altri effettori) sia nel controllo in presenza di Cys, NAC e CMC a dimostrazione del fatto che questi agenti antiossidanti non hanno alcun effetto sull’attività di trasporto di OCTN1.

L’aggiunta di Cys e NAC dopo 20 minuti di incubazione dei proteoliposomi con HgCl2

causa un completo ripristino dell’attività di trasporto, mentre la CMC sembra non avere alcun effetto. L’aggiunta di Cys, CMC e NAC ai proteoliposomi dopo 20 minuti di incubazione con MeHg causa invece un ripristino dell’attività di trasporto pari rispettivamente al 92%, 83% e 79% . Nel caso del CdCl2 invece è stato rilevato un leggero rispristino dell’attività di trasporto

Risultati

123 dopo l’aggiunta di Cys e NAC (68% e 72%), mentre nessuno effetto è stato osservato dopo l’aggiunta di CMC.

Figura 10: Effetto di Cys, NAC e CMC sull’inibizione dell’antiport di TEA da parte di HgCl2, MeHg e

CdCl2. I proteoliposomi sono stati incubati con HgCl2 e MeHg 18 µMe CdCl2 60 µM, dopo due minuti sono

stati aggiunti ai proteoliposomi Cys, NAC e CMC 5 mM. Dopo 15 minuti i proteoliposomi sono stati fatti passare attraverso una colonna cromatografica contenente la resina Sephadex G-75 e l’attività di trasporto è stata valutata dopo 60 minuti come descritto in Materiali e Metodi. Nel grafico è riportata la percentuale di attività residua rispetto al controllo. I valori rappresentano la media e deviazione standard di tre esperimenti indipendenti .

3.2.2 CINETICA DI INIZIONE DEL SISTEMA DI TRASPORTO hOCTN1 DA