VALUTAZIONE E QUANTIFICAZIONE DELLA MORTE CELLULARE PER NECROSI E APOPTOSI A SEGUITO DELLA SOMMINISTRAZIONE DI FARMAC

Dopo l’identificazione dei biomarcatori che maggiormente vengono espressi è stata focalizzata l’attenzione su due processi cellulari correlati alla tossicità dei farmaci: l’apoptosi e la necrosi. Questo perché a seguito di differenti fattori endogeni ed esogeni la cellula può rispondere o tramite morte programmata, ovvero apoptosi, oppure morte diretta della cellula per necrosi.

Per la valutazione e la quantificazione della necrosi le cellule sono state trattate con quattro differenti concentrazioni di farmaco per 24 ore; nel caso del BEA le concentrazioni utilizzate

B

A

D

C

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143 sono state 1 µM ,3 µM, 10 µM e 30 µM, mentre nel caso del cisplatino e della ciclosporina 1µM, 3 µM, 5 µM e 10 µM. Dopo un giorno di esposizione al farmaco, una popolazione controllo di cellule è stata digerita in trispsina in modo da ottenere il numero totale di cellule presenti sulla piastra, mentre dalle popolazioni cellulari trattate con i farmaci è stato prelevato il mezzo di coltura nel quale vi sono le cellule necrotiche in sospensione.

Nella figura 22 si vede come dopo l’aggiunta del BEA non si ha un significativo incremento delle cellule necrotiche. Le immagini ottenute tramite microscopia ottica mostrano infatti che nonostante l’aggiunta di BEA le cellule continuano a mantenere la propria morfologia e le colonie sono integre anche alla concentrazione più elevata di farmaco. L’istogramma mostra la quantificazione delle cellule necrotiche presenti nelle colture cellulari trattate con il farmaco rispetto al controllo, come mostrato dal grafico la percentuale di cellule necrotiche presenti nel controllo è pari al 13%, mentre risulta essere pari 21% nelle cellule trattate con BEA 1µM , 25% nelle cellule trattate con BEA 3µM, 23% nelle cellule trattate con BEA 10µM e infine 27% nelle cellule a cui è stato aggiunto BEA 30µM.

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144 Figura 22: Valutazione e quantificazione delle cellule necrotiche in colture primarie di rene di topo: l’istogramma mostra la percentuale di cellule necrotiche presenti nel mezzo di coltura, rispetto al numero totale di cellule, a seguito della loro esposizione per 24 ore a quattro differenti concentrazioni di BEA (1μM, 3μM, 10μM, 30μM). Nel controllo le cellule sono state incubate per 24 in mezzo di coltura REGM semplice. Le immagini sono state ottenute tramite microscopio ottico (magnificazione 4X) e mostrano l’effetto delle varie concentrazioni di BEA sulle culture cellulari. I risultati ottenuti derivano dalla media di tre differenti isolamenti (N=3).I dati significativamente differenti dal controllo sono stati determinati tramite t-test, e sono indicati con (*) per p < 0.05 o con (**) per p < 0.01.

Nel secondo esperimento (figura 23) invece a quattro colture cellulari differenti sono state aggiunte quattro diverse concentrazioni di cisplatino (1µM, 3µM, 5µM,10 µM). Le immagini ottenute tramite microscopia ottica mostrano come all’aumentare della concentrazione di farmaco si ha un notevole incremento della mortalità delle cellule e conseguente riduzione delle colonie sopravvissute sulla piastra. L’istogramma mostra un aumento delle cellule necrotiche nel mezzo di coltura proporzionale alla concentrazione di farmaco somministrata, in particolare già dopo l’aggiunta di cisplatino 1 µM la percentuale di cellule necrotiche

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145 risulta pari al 27%, rispetto al 12% rilevato nel controllo, mentre dopo la somministrazione di cisplatino 3 µM e 5 µM tale percentuale sale rispettivamente al 33% e 46%. Aumentando ulteriormente la concentrazione di farmaco (10µM) si ottiene una percentuale di cellule necrotiche pari al 68% delle cellule totali.

Figura 23 : Valutazione e quantificazione delle cellule necrotiche in colture primarie di rene di topo: l’istogramma mostra la percentuale di cellule necrotiche presenti nel mezzo di coltura, rispetto al numero totale di cellule, a seguito della loro esposizione per 24 ore a quattro differenti concentrazioni di cisplatino (1μM, 3μM, 5 μM, 10μM). Nel controllo le cellule sono state incubate per 24 in mezzo di coltura REGM semplice. Le immagini sono state ottenute tramite microscopioottico (magnificazione 4X) e mostrano l’effetto delle varie concentrazioni di Cisplatino sulle culture cellulari. . I risultati ottenuti derivano dalla media di tre differenti isolamenti (N=3). I dati significativamente differenti dal controllo sono stati determinati tramite t-test, e sono indicati con (*) per p < 0.05 o con (**) per p < 0.01.

Nell’ultimo esperimento (figura 24) a quattro colture cellulari differenti sono state aggiunte quattro diverse concentrazioni di ciclosporina (1µM, 3µM, 5µM,10 µM). Le immagini ottenute tramite microscopia ottica mostrano come nel caso della ciclosporina all’aumentare

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146 della concentrazione di farmaco si ha un significativo incremento della mortalità delle cellule, il numero di colone sopravvissute infatti tende a diminuire specialmente dopo la somministrazione di alte dosi di ciclosporina. L’istogramma mostra come dopo l’esposizione delle cellule a ciclosporina 1µM il numero di cellule necrotiche è pari al 22% rispetto al 12% rilevato nel controllo, mentre dopo l’aggiunta delle concentrazioni 3µM e 5µM la percentuale di sale rispettivamente al 28% e 37%. Infine nelle cellule trattate con ciclosporina 10 µM la percentuale di cellule necrotiche arriva al 61% .

Figura 24 : Valutazione e quantificazione delle cellule necrotiche in colture primarie di rene di topo : l’istogramma mostra la percentuale di cellule necrotiche presenti nel mezzo di coltura, rispetto al numero totale di cellule, a seguito della loro esposizione per 24 ore a quattro differenti concentrazioni di Ciclosporina (1μM, 3μM, 5 μM, 10μM). Nel controllo le cellule sono state incubate per 24 in mezzo di coltura REGM semplice. Le immagini sono state ottenute tramite microscopio ottico (magnificazione 4X) e mostrano l’effetto delle varie concentrazioni di ciclosporina sulle culture cellulari. I risultati ottenuti derivano dalla media di tre differenti isolamenti (N=3). I dati significativamente differenti dal controllo sono stati determinati tramite t-test, e sono indicati con (*) per p < 0.05 o con (**) per p < 0.01.

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147 Successivamente è stata valutata la percentuale di cellule apoptotiche a seguito dell’ esposizione a varie concentrazioni di farmaco. Questo saggio si basa sul principio che le terminazioni libere 3’-OH che si vengono a formare in seguito alla frammentazione del DNA possano servire come substrato per la terminal deossinucleotidil transferasi (TdT). Utilizzando come substrato dUTP biotinilato è così possibile distinguere in una popolazione le cellule apoptotiche. Nel primo esperimento (figura 25) le cellule primarie di rene di topo sono state trattate con tre differenti concentrazioni di BEA (3µM, 10 µM e 30µM).

La percentuale di cellule presenti nel controllo, ovvero nelle cellule non trattate con il farmaco, è pari al 1%, questo perché in condizioni fisiologiche vi è comunque una percentuale di cellule apoptotiche anche se pur minima. Nelle cellule trattate con le concentrazioni bassa e media di BEA (3 µM, 10 µM) la percentuale di cellule positive al saggio risulta del tutto simile al controllo (1,5%), cioè indica che queste concentrazioni di farmaco non innescano processi apoptotici a livello cellulare. A seguito invece dell’aggiunta della concentrazione alta di BEA (30 µM) si nota un aumento delle cellule apoptotiche pari al 3,4% .

Le immagini ottenute tramite microscopia a fluorescenza evidenziano i nuclei apoptotici che presentano una colorazione più chiara (azzurra) e cromatina condensata, rispetto ai nuclei non apoptotici che invece hanno una colorazione blu.

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148 Figura 25 : Valutazione e quantificazione delle cellule apoptototiche in colture primarie di rene di topo trattate con BEA: l’istogramma mostra la percentuale di cellule apoptotiche presenti in una popolazione a seguito dell’ esposizione per 24 ore a 3 differenti concentrazioni di BEA (3μM, 10μM, 30μM). Nel controllo le cellule sono state incubate per 24 nel mezzo di coltura REGM. A tali cellule è stato effettuato il saggio tunel per la valutazione dei nuclei apoptotici come descritto in Materiali e Metodi. Le immagini sono state ottenute tramite microscopia a fluorescenza (magnificazione 40X) e mostrano i nuclei delle cellule, in blu sono indicati i nuclei non apoptotici, mentre i nuclei in cui è avvenuta la frammentazione del DNA a seguito del processo di apoptosi presentano una colorazione più chiara. I risultati ottenuti derivano dalla media di tre differenti isolamenti (N=3). I dati significativamente differenti dal controllo sono stati determinati tramite t-test, e sono indicati con (*) per p < 0.05 o con (**) per p < 0.01.

Nel secondo esperimento (figura 26) le cellule primarie di rene di topo sono state trattate con tre differenti concentrazioni di cisplatino (1µM, 3 µM e 5µM). Dopo l’aggiunta della concentrazione bassa di cisplatino la percentuale di cellule apoptotiche è pari a 1,75%, valore dunque molto simile alle cellule positive presenti nel controllo (1,1%), mentre dopo l’aggiunta delle concentrazioni media e alta di cisplatino, si nota un significativo incremento delle cellule in fase di apoptosi, rispettivamente pari al 4% e 7,5%. Inoltre osservando i nuclei a seguito dell’aggiunta della concentrazione alta di cisplatino si nota un cambiamento

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149 della loro morfologia che è dovuto alla loro frammentazione e alla condensazione della cromatina entrambi eventi tipici dell’apoptosi.

Figura 26 : Valutazione e quantificazione delle cellule apoptototiche in colture primarie di rene di topo trattate con cisplatino : l’istogramma mostra la percentuale di cellule apoptotiche presenti in una popolazione a seguito dell’ esposizione per 24 ore a 3 differenti concentrazioni di cisplatino (1μM, 3μM, 5μM). Nel controllo le cellule sono state incubate per 24 nel mezzo di coltura REGM. A tali cellule è stato effettuato il saggio Tunel per la valutazione dei nuclei apoptotici come descritto in Materiali e Metodi. Le immagini sono state ottenute tramite microscopia a fluorescenza (magnificazione 40X) e mostrano i nuclei delle cellule, in blu sono indicati i nuclei non apoptotici, mentre i nuclei in cui è avvenuta la frammentazione del DNA a seguito del processo di apoptosi presentano una colorazione più chiara. . I risultati ottenuti derivano dalla media di tre differenti isolamenti (N=3). I dati significativamente differenti dal controllo sono stati determinati tramite t-test, e sono indicati con (*) per p < 0.05 o con (**) per p < 0.01.

Infine le cellule primarie di rene di topo (figura 27) sono state trattate con tre differenti concentrazioni di ciclosporina (1µM, 3 µM e 5µM). Dopo l’aggiunta della concentrazione bassa di ciclosporina la percentuale di cellule apoptotiche è pari a 2,6%, quindi già alle basse concentrazioni di farmaco si nota un incremento dei fenomeni di apoptosi rispetto al controllo (1,1%), dopo l’aggiunta delle concentrazioni media (3µM) e alta (5µM) di ciclosporina si

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150 nota un significativo incremento del numero di cellule apoptotiche, la percentuale infatti sale rispettivamente al 4,2% e 7,4%.

Figura 27: Valutazione e quantificazione delle cellule apoptototiche in colture primarie di rene di topo trattate con ciclosporina: l’istogramma mostra la percentuale di cellule apoptotiche presenti in una popolazione a seguito dell’ esposizione per 24 ore a 3 differenti concentrazioni di ciclosporina (1μM, 3μM, 5μM). Nel controllo le cellule sono state incubate per 24 nel mezzo di coltura REGM. A tali cellule è stato effettuato il saggio Tunel per la valutazione dei nuclei apoptotici come descritto in Materiali e Metodi. Le immagini sono state ottenute tramite microscopia a fluorescenza (magnificazione 40X) e mostrano i nuclei delle cellule, in blu sono indicati i nuclei non apoptotici, mentre i nuclei in cui è avvenuta la frammentazione del DNA a seguito del processo di apoptosi presentano una colorazione più chiara. . I risultati ottenuti derivano dalla media di tre differenti isolamenti (N=3). I dati significativamente differenti dal controllo sono stati determinati tramite t-test, e sono indicati con (*) per p < 0.05 o con (**) per p < 0.01.

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151 3.5 VALUTAZIONE DELLA FUNZIONALITÀ DEGLI ORGANELLI