Cellule provenienti da claustro

Per quanto riguarda il claustro, si sono acquisite delle immagini da vetrini fissati.

Questi sono stati preparati dai collaboratori della prof.ssa Maura Castagna, del Laboratorio di Anatomia Patologica della Facoltà di Medicina e Chirurgia dell’Università di Pisa.

Il materiale utilizzato per ottenere i vetrini è autoptico, proveniente da cervelli di individui sani.

I vetrini sono stati ottenuti fissando slice, di diverso spessore, di claustro.

I vetrini contengono slice di claustro, regione della sostanza grigia cerebrale, di spessore variabile: in particolare, 10 µm, 20 µm e 30 µm. Le acquisizioni sono state eseguite a 40X, e non a 20X come negli scorsi lavori di tesi. A 20X, infatti, il rumore di background risultava essere maggiore rispetto alle acquisizioni a 40X, in cui invece le cellule appaiono scure, rispetto al background, più chiaro con poco rumore, come mostrato in Fig. 13

Il problema dell’acquisizione a ingrandimenti così elevati è che non sempre è possibile racchiudere nel campo visivo della fotocamera collegata al microscopio l’intera cellula: è necessario, quindi, acquisire il neurone in più immagini, e poi fonderle insieme in modo da ottenerne una sola, idonea all’elaborazione e alla successiva analisi morfologica.

Per fare questo, ci si è avvalsi di un particolare tool interattivo di Matlab, il Control Point Selection Tool.

Nell’Appendice C sono riportate le righe di codice implementate per questo tipo di operazione.

Prima di caricare le immagini nel tool, si è operato un miglioramento del contrasto, dove necessario, e, per migliorare le prestazioni computazionali, si è processata l’immagine in modo da ottenerne una in livelli di grigio: ciò permette di avere un’immagine rappresentata da una matrice bidimensionale e non tridimensionale, diminuendo i tempi di elaborazione, ma allo stesso tempo non perdendo informazioni utili: l’obiettivo, infatti, è sempre ottenere lo scheletro del neurone, che è un’immagine binaria.

Ritornando al Control Point Selection Tool, esso permette di caricare all’interno di una GUI, richiamata sul workspace di Matlab attraverso uno specifico comando (Fig. 14)

Fig. Fig. 14 Schermata del Control Point Selection Tool

Le due immagini sono visualizzate nella loro interezza in basso, e su di esse è presente un riquadro mobile: in questo modo, l’utente può selezionare una zona del neurone da ingrandire; tale ingrandimento è visibile nella GUI stessa, in alto. Nei riquadri in cui le immagini sono zoomate, l’utente può, cliccando con il mouse, individuare dei repere, o landmark. Questi sono dei punti che si utilizzeranno come riferimento: infatti, a coppie, questi identificano una stessa zona anatomica neuronale. Il numero di landmark da selezionare è funzione della trasformazione che si vuole compiere per ottenere la registrazione. Infatti, è possibile implementare, attraverso opportuni parametri previsti nella sintassi Matlab, diversi tipi di trasformazioni che permettono la registrazione di due immagini. In questo caso, il microscopio non distorce in modo significativo le immagini, quindi è possibile utilizzare per la “fusione” una delle più semplici trasformazioni globali. Per questo tipo di trasformazione, sono necessarie almeno due coppie landmark, ma per aumentare la precisione nella registrazione se ne sono individuate almeno tre

coppie. Completata la ricerca dei repere, attraverso la GUI se ne esportano sul workspace di Matlab le coordinate x e y di ciascun punto, organizzate in due matrici, una per ogni immagine.

A questo punto, si può procedere con l’analisi morfologica, attraverso l’interfaccia grafica presente all’interno di Ne.Mo., ottenendo per ogni cellula dei datamatrix di dimensioni 1*177.

Si è successivamente organizzato il datamatrix complessivo, in modo da renderlo idoneo all’elaborazione con la tecnica di analisi multivariata Tucker3.

In primo luogo, si sono estratte le otto variabili, dalle 177 ottenute dall’analisi morfologica (vedi paragrafo 4.1.1).

Si è notato, successivamente, che all’interno del claustro ci sono due diversi tipi di cellule: si possono notare neuroni che si sviluppano lungo una direzione preferenziale (Fig. 15)

Fig. 15 Neuroni che si estendono lungo una direzione preferenziale

Fig. 16 Esempio di neurone con estensione radiale a 360°

Come già evidenziato, i neuroni sono fotografati da vetrini contenenti slice di claustro con diverso spessore, in particolare 10 µm, 20 µm e 30 µm. Si è quindi pensato, per ogni spessore, di prendere tre neuroni del primo tipo e tre del secondo, per un totale di 6 neuroni: questi rappresenteranno, all’interno del datamatrix, gli oggetti.

Il numero esiguo di cellule è dovuto al fatto che non si avevano a disposizione tanti vetrini su cui fotografare i neuroni.

Come condizione si sono considerati i tre diversi spessori delle slice di claustro, da cui sono stati fotografati i due tipi neuronali.

Il datamatrix finale, quindi, avrà dimensioni (3*6)*8.

L’obiettivo di quest’analisi è dimostrare che la tecnica Tucker3, applicata in questo particolare caso, riesce a visualizzare le differenze che ci sono tra i due tipi neuronali individuati. Si analizzerà, quindi, solo il plot degli oggetti, essendo questo il più significativo tra i grafici.

Il risultato è visibile in Fig. 17: anche in questo caso, non c’è differenza nei risultati ottenuti con l’editor Matlab o con il plug-in.

Fig. 17 Grafico degli oggetti

Come nei casi discussi, è necessario dare un significato agli assi, per poter poi interpretare il grafico: in questo caso, l’asse delle x

rappresenta la direzionalità con verso crescente da destra verso sinistra, mentre l’asse y rappresenta la complessità dell’albero dendritico, con verso crescente dal basso verso l’alto. A questo punto, è possibile analizzare il plot degli oggetti, che giustificherà la scelta dell’interpretazione degli assi.

► Grafico delle cellule

Si riporta in Fig.18 il grafico degli oggetti, con la relativa interpretazione data agli assi.

Fig. 18 Grafico degli oggetti interpretato in base al significato degli assi

Osservando il grafico, si possono effettivamente dividere gli oggetti in due cluster:

1. Cluster 1 (verde): raggruppa le cellule più direzionali;

2. Cluster 2 (blu): raggruppa le cellule che si estendono a 360°, quindi meno direzionali.

All’interno dei due cluster, è possibile individuare cellule con complessità variabile. Ad esempio, la cellula contrassegnata dal numero “2” (Fig. 19) è effettivamente una cellula poco direzionale, e che, inoltre, presenta poca complessità nella struttura morfologica dell’albero dendritico.

Fig. 19 Esempio di cellula (cellula no.2)

In definitiva, dunque, il metodo Tucker3 riesce nella classificazione di diversi tipi cellulari, e all’interno dei vari cluster, rileva ulteriori differenze.