L'acido 1,2-bis(o-ammino-fenossi)etano-N,N,N',N'-tetracetico–acetossimetilestere (BAPTA- AM) è un composto lipofilico che attraversa facilmente la membrana plasmatica. All'interno della cellula è scisso rapidamente dall'esterasi citosoliche rilasciando BAPTA, un composto idrofilico che rimane intrappolato nella cellula e agisce da chelante del calcio. Il BAPTA-AM viene utilizzato frequentemente per valutare il ruolo del calcio intracellulare in molti processi, ed è risultato avere diversi effetti in vari tipi cellulari: protegge dal danno da radicali liberi, promuove l'apoptosi in cellule non neuronali (Wie et al., 2001), nei neuroni protegge dal danno ischemico ed eccitotossico (Tymianscki et al., 1994).
1.11.2 EDTA
L'EDTA (acido etilendiamminotetraacetico) è un acido tetracarbossilico in grado di formare complessi stabili con gli ioni calcio e magnesio. Per questa sua caratteristica viene largamente usato in biochimica e in biologia molecolare ed è risultato avere un effetto protettivo in vari
tipi cellulari neuronali, tra cui nelle cellule dei granuli del cervelletto (Al-Gonaiah et al.,
2009) e nei neuroni ippocampali CA1 (Calderone et al., 2004).
1.12 Le caspasi
L'apoptosi procede attraverso cambiamenti morfologici che sono dipendenti dall'attività delle caspasi. Le caspasi sono proteasi che possiedono una cisteina nel sito attivo ed effettuano il taglio dei substrati dopo un residuo aspartato. La specificità di una caspasi è determinata da 4 residui amminoterminali al sito di taglio. Sono sintetizzate come zimogeni a singola catena e richiedono un processo di attivazione altamente regolato (Park, 2012; Salvesen and Riedl, 2008).
Le caspasi sono suddivise in 2 gruppi principali in base alla loro sequenza di attivazione e al loro ruolo nell'apoptosi: le caspasi iniziatrici come la caspasi-2, -8, -9 e -10 e le caspasi esecutrici come la caspasi-3 e -7. Le caspasi iniziatrici hanno un prodominio N-terminale per l'interazione proteina-proteina e sono generalmente monomeriche nella proforma. Sono attivate e auto-processate attraverso la dimerizzazione indotta da complessi specifici conosciuti come DISC (death-inducing signaling complex) per le caspasi-8 e -10, Apoptosoma per la caspasi-9 e PIDDosoma per la caspasi-2. Una volta attivate, le caspasi
iniziatrici agiscono sulle caspasi esecutrici che hanno il compito di processare i substrati necessari per la morte cellulare programmata.
1.12.1 La caspasi-8
La caspasi-8 è la caspasi responsabile della trasmissione dei segnali apoptotici ad opera di Fas, il recettore per il fattore di necrosi tumorale (TNFR) e dei recettori simili al TNFR. Il legame di Fas con il suo ligando recluta direttamente la proteina adattatrice FADD (Fas associated death domain), la procaspasi-8 o la procaspasi-10 e c-FLIP al complesso DISC (death-inducing signaling complex). Al contrario il legame di TNFR con il suo ligando non recluta direttamente FADD o la procaspasi-8 al recettore ma procede tramite due tappe svolte in complessi differenti. Il complesso I legato alla membrana plasmatica viene formato rapidamente a seguito dell'attivazione del recettore e contiene il recettore stesso, la proteina adattatrice TRADD (TNFR-associated death domain), RIP 1 (una serina/treonina chinasi contenente un dominio di morte) e TRAF-2 che portano all'attivazione del fattore di trascrizione NF-κB. A questo punto il complesso I lascia il recettore e forma un altro complesso stabile, il complesso II che si localizza prevalentemente nel citosol e contiene proteine apoptotiche come FADD, procaspasi-8 o procaspasi-10 ed e questo complesso che porta alla morte cellulare. Come venga attivata la caspasi-8 da DISC o dal complesso II non è ancora completamente chiaro ma si pensa che il processo coinvolga la dimerizzazione indotta dalla vicinanza delle procaspasi e la processazione autocatalitica (Salvesen and Riedl, 2008; Park, 2012). La caspasi-8 oltre ad andare ad agire sulla caspasi-3, è in grado di tagliare RIP, caspasi-7 e -9. La procaspasi-8 si localizza nello spazio mitocondriale intermembrana, nella membrana mitocondriale interna e nella matrice. Si pensa che una volta ricevuto lo stimolo apoptotico la procaspasi-8 immagazzinata nei mitocondri sia rilasciata e diventi disponibile nel citosol (Chandra et al., 2004). La caspasi-8 una volta attivata va a sua volta a processare la
caspasi-3 e la proteina Bid, generando così la forma troncata t-Bid. Quest'ultima trasloca alla membrana mitocondriale esterna e promuove l'oligomerizzazione di Bax o Bak per facilitare il rilascio dallo spazio intermembrana del citocromo c ed altre proteine proapoptotiche. La formazione di t-Bid lega la via estrinseca con la via mitocondriale o intrinseca, caratterizzata dal rilascio del citocromo c.
1.12.2 La caspasi-9
Il citocromo c rilasciato nel citosol, forma un complesso chiamato apoptosoma insieme alla procaspasi-9 e ad Apaf-1 (apoptotic protease activating factor 1). Apaf-1 possiede tre domini funzionali: il dominio N-terminale responsabile del reclutamento della caspasi (CARD, caspase recruitment domain), il dominio centrale di oligomerizzazione e legame dei nucleotidi, e il dominio C-terminale con funzione regolatoria. La regione regolatoria normalmente mantiene Apaf-1 in uno stato autoinibitorio in una forma compatta ripiegata su se stessa (Kim et al., 2005). Il citocromo c, in presenza di dATP o ATP, dispiega la molecola rendendola in grado di formare un eptamero a forma di ruota con altre molecole di Apaf-1 leganti il citocromo c nel cui anello centrale risiede il sito di legame per le procaspasi-9. In questo modo si ipotizza avvenga un fenomeno di dimerizzazione per le caspasi simile a quello descritto per le caspasi-8. A differenza delle caspasi-8 però questo dimero ha solamente un solo dominio attivo, l'altro mantiene la sua conformazione di zimogeno con l'apparato catalitico e i determinanti per la specificità disattivati (Salvesen and Riedl, 2008).
1.12.3 Le caspasi esecutrici
In forte contrasto con le caspasi iniziatrici, gli zimogeni delle caspasi esecutrici 3 e 7 si presentano nel citosol come dimeri inattivi. Sono attivati dalla proteolisi dei linker tra i domini, ad opera di una caspasi iniziatrice o da un’ altra proteasi. Anche la caspasi-6, sebbene non sia stata ampiamente studiata, è classificata tra le caspasi esecutrici sia perchè manca di un lungo prodominio sia perchè si presume agisca ad un livello più tardivo rispetto a quelle iniziatrici. Il sito attivo pare sia posizionato su loop flessibili piuttosto che in zone con una struttura secondaria ordinata. Le caspasi esecutrici hanno un N-terminale più corto rispetto a quelle iniziatrici che pur non prendendo parte al meccanismo di attivazione, è tuttavia necessario affinchè esso avvenga in vivo (Boatright and Salvesen, 2003; Salvesen and Riedl, 2008).
La caspasi-3 è la responsabile della maggior parte degli eventi proteolitici che avvengono durante l'apoptosi. Studi recenti hanno evidenziato il suo ruolo in processi non apoptici necessari per il funzionamento del sistema nervoso (Yakovlev and Gulyaeva, 2011).