Ciclo di vita dei papillomavirus umani

Il ciclo di vita degli HPV è strettamente dipendente dallo stato di differenziazione della sua cellula ospite , il cheratinocita, ed è regolato da un certo numero di proteine cellulari [Stubenrauch F, Laimins LA. 1999]. Il tropismo degli HPV per i cheratinociti non sembra, infatti, dipendere dalla presenza di specifici recettori presenti sulla superficie della cellula ospite, ma piuttosto dalla presenza di promotori specifici localizzati nella regione LCR del genoma virale, soggetti a fattori di regolazione trascrizionale virali e cellulari. L’infezione avviene nelle cellule staminali dello strato basale attraverso microlesioni. Una volta penetrato nella cellula ospite, il virus si stabilisce nel nucleo come elemento extracromosomico. Il promotore precoce viene

54

attivato e vengono prodotto le proteine E1 ed E2 che, rapidamente, consentono la replicazione del genoma virale fino a 50-100 copie episomali per cellula. Il numero di copie genomiche, dopo questa fase iniziale costitutiva, viene mantenuto costante e la replicazione avviene in sincronia con quella della cellula ospite. Quando la cellula infettata si divide, una delle due cellule figlie esce dallo strato basale ed intraprende il suo programma di differenziamento, mentre l’altra cellula figlia rimane nello strato basale e costituisce un reservoir di cellule indifferenziate in cui in DNA virale si mantiene in forma latente. Durante la differenziazione della cellula infetta, il promotore tardivo viene attivato e quindi inizia la fase produttiva del ciclo di vita, con massiccia replicazione dei genomi virali fino a migliaia di copie, espressione dei geni tardivi ed assemblaggio del virione. Paradossalmente, questi eventi si verificano nelle cellule che normalmente escono dal ciclo cellulare e non sono più in fase di proliferazione. HPV altera il ciclo cellulare soprattutto attraverso l’azione delle proteine E6 ed E7, riuscendo così a mantenere in fase attiva del ciclo cellulare un gruppo di cellule infette e ad assicurarsi l’espressione di quei fattori cellulari necessari per la replicazione del DNA virale [Garner-Hamrick PA. et al. 2004].

A causa della difficoltà incontrata nella produzione di grandi quantità di virus sia in sistemi in vivo ché in vitro, è stato difficile studiare i meccanismi attraverso cui gli HPV entrano nelle cellule e stabiliscono un’ infezione produttiva. L’interazione tra HPV e superficie cellulare è stata pertanto indagata utilizzando degli pseudo-virioni formati da proteine L1 ed L2 auto assemblatesi in sistemi eterologhi di espressione (VLP: virus-like particles) ed un plasmide reporter al posto del genoma. I papillomavirus possono legarsi a cellule di vari tessuti e di varie specie, indicando che il recettore di legame iniziale è ampiamente diffuso [M Müller L. et al. 1995]. Diversi recettori sono stati proposti come possibili iniziali bersagli di legame del virus, e tra questi i proteoglicani eparan solfato [Shafti-Keramat S. et al. 2003] e l’integrina α6 [McMillan NA. et al. 1999]. Si ipotizza che il legame iniziale di L1 possa essere necessario ad indurre un cambiamento conformazionale nel capside, permettendo ad L2 di interagire con un recettore secondario, e portando all’internalizzazione [Yang R. et al. 2003]. La maggior parte dei papillomavirus sembra entrare nella cellula attraverso un meccanismo clatrina dipendente che richiede l’acidificazione degli endosomi [Day PM. et al. 2003], all’interno dei quali avviene lo scapsidamento virale e la liberazione del genoma. La proteina capsidica L2 gioca un ruolo cruciale nella fuoriuscita del genoma virale dall’endosoma e quindi per il suo rilascio nel citoplasma

55

cellulare; L2, infatti, non solo destabilizza la membrana endosomiale [Kämper N. et al. 2006], ma facilita il trasferimento del genoma virale a specifici domini nucleari per stabilirvi l’infezione [Day PM. et al. 2004].

Una volta entrato nel nucleo, il genoma virale vi si instaura sotto forma di episomi multicopia che rimangono numericamente stabili fino alla successiva divisione cellulare (Fig. 14). Queste fasi iniziali del ciclo di vita virale richiedono l’espressione dei trascritti derivanti dal promotore precoce, che codificano per le oncoproteine E6 ed E7, così come per le proteine della replicazione E1 ed E2. La trascrizione a partire dal promotore precoce è controllata dal legame di fattori di trascrizione cellulari a sequenze di riconoscimento specifiche che si trovano nella LCR. E’ proprio il legame differenziale tra questi fattori cellulari e le sequenze virali enhancer che contribuisce alla restrizione dell’infezione da HPV alle cellule di origine epiteliale [Chong T. et al. 1991]. L’espressione dei geni virali precoci, inclusi quelli per i fattori della replicazione virale, contribuisce al controllo del numero di copie virali nelle cellule indifferenziate. Il mediatore principale di questa attività è la proteina E2 che funziona come regolatore trascrizionale virale oltre ad avere un ruolo aggiuntivo nella replicazione [Stubenrauch F. et al. 1998]. E2 si lega sotto forma di dimero alle sequenze palindromiche ACCN6GGT che, nel loro insieme, formanol’E2-binding site (E2BS). Alcuni E2BS sono presenti non solo nella LCR, ma anche a monte del sito di inizio della trascrizione di E6 e circa 500 nucleotidi più a valle. La replicazione del DNA virale è mediata da E1 ed E2 che agiscono in sincronia con le proteine della replicazione del DNA cellulare. La proteina E1 è altamente conservata tra i vari papillomavirus e possiede varie attività tra cui quella di legame al DNA in maniera sito specifica, ATPasica DNA-dipendente ed elicasica [F J Hughes and M A Romanos. 1993. Raj K. et al. 1995]. L’origine della replicazione virale si trova in una zona ricca di A/T nella LCR, adiacente al sito di inizio del promotore tardivo, ed è costituito da siti di legame per E1 ed E2 [A M Del Vecchio et al. , 1992]. E1 può legare l’origine della replicazione virale, ma lo fa con bassa affinità. Invece, attraverso una complessa interazione, E1 ed E2 cooperano a legare l’origine con alta affinità [J Sedman and A Stenlund, 1995]. I genomi virali vengono replicati in sincronia con il DNA cellulare durante la fase S e vengono ripartiti equamente nelle cellule figlie durante la mitosi.

56

Fig. 14: Ciclo replicativo di HPV nel contesto dell’epitelio squamoso stratificato.

Le proteine E1 ed E2 non sono le uniche proteine virali necessarie a mantenere stabili gli episomi nelle cellule indifferenziate. E’ necessaria anche l’espressione di E6 ed E7 per mantenere stabili gli elementi extra cromosomici [Thomas JT. et al., 1999]. Entrambe le proteine E6 ed E7 dei genotipi ad alto rischio sono oncoproteine virali multifunzionali che interagiscono con molte proteine cellulari. E’ interessante notare che il ruolo di queste proteine nella gestione degli episomi virali si esplica anche nei genotipi di HPV a basso rischio [Jennifer T. Thomas et al., 2001]. La proteina E7 degli HPV ad alto e basso rischio è una oncoproteina nucleare di circa 100 amminoacidi, divisa in tre regioni conservate: un dominio amino-terminale (CR1), un dominio centrale che contiene il sito di legame LXCXE per pRb (CR2), ed un dominio carbossi-terminale che contiene due motivi a dita di zinco (CR3) [Gage JR. et al., 1990]. La capacità di E7 di legare e degradare i membri della famiglia Rb è una importante funzione dei genotipi ad alto rischio. Anche la proteina E7 dei genotipi a basso rischio lega Rb, ma con ridotta affinità [Münger K. et al., 1989]. I membri della famiglia Rb (pRb, p107 e p130) sono necessari al controllo del ciclo cellulare che avviene in gran parte attraverso la regolamentazione della famiglia di fattori di trascrizione E2F [Dyson N., 1998]. Il legame di E7 ad Rb ipofosforilato porta al rilascio del fattore E2F necessario per la trascrizione dei geni coinvolti nella proliferazione e progressione del ciclo cellulare. La proteina E6, invece, ha la capacità di legare e promuovere la degradazione di p53 [Scheffner M. et al., 1990]. In questo modo, risulta compromessa la capacità della cellula ospite di controllare il ciclo cellulare e la risposta apoptotica. Non è chiaro se i genotipi di HPV a basso rischio

57

leghino p53, ma è chiaro che essi non ne mediano la degradazione [X Li and P Coffino, 1996]. Comunque, la proteina E6 dei genotipi ad alto e basso rischio ha in, entrambi i casi, la potenzialità di perturbare il potenziale transattivante di p53. L’alterazione dell’attività trascrizionale di p53 viene ottenuta interferendo con il legame di p53 ai suoi siti di legame sul DNA [MS. Lechner and LA. Laimins. 1994] oppure, come avviene per la proteina E6 dei genotipi ad alto rischio, attraverso l’interazione con i coattivatori trascrizionali p300/CBP [Patel D. et al., 1999].

La fase produttiva del ciclo di vita virale avviene negli strati terminali dell’epidermide composti da cellule differenziate, dove le particelle virali vengono assemblate e rilasciate. La differenziazione delle cellule infette induce un drammatico incremento nell'espressione dei geni tardivi, portando all’amplificazione del genoma ed alla sintesi dei virioni [Stubenrauch F. et al., 1999]. I trascritti espressi a partire dal promotore precoce rimangono invariati durante il processo di differenziamento, e questo porta ad una espressione continua, seppur a bassi livelli, delle oncoproteine E6 ed E7 attraverso tutti gli strati dell’epitelio. A seguito dell’inizio del processo di differenziamento cellulare, ha inizio anche la trascrizione tardiva dei geni virali a partire dal promotore tardivo (p742 in HPV31 e p670 in HPV16) localizzato all’estremità 3’ dell’ORF di E7 [K Grassmann et al., 1996]. I trascritti tardivi terminano o alla fine del gene E5 o del gene L1, grazie l’azione di sequenze di poliadenilazione che sono conservate tra i papillomavirus. I messaggeri tardivi codificano per E4, E5, L1 ed L2. L’esatto meccanismo con cui il differenziamento cellulare controlla le fasi produttive del ciclo di vita virale è ancora argomento di studio. In seguito al differenziamento, la produzione di E1 ed E2 passa dal controllo del promotore precoce, strettamente regolato da E2, sotto il controllo del promotore tardivo la cui funzione è indipendente da E2 [G Steger and S Corbach, 1997]. Questo cambiamento nell’uso del promotore porta ad un incremento dell’espressione di E1 ed E2, con successiva amplificazione dei genomi virali fino a migliaia di copie per cellula. L’ espressione della proteina E7 durante le fasi di differenziamento cellulare, ha la funzione di creare un ambiente cellulare favorevole alla fase produttiva del ciclo di vita virale. E7 mantiene in fase attiva del ciclo cellulare le cellule che si stanno differenziando, e lo fa attraverso il legame con pRb /p130/ p107 di cui media anche la degradazione [A Felsani, et al., 2006]. Questo facilita il rientro della cellula in fase S e permette alla replicazione virale produttiva di avvenire anche nelle cellule differenziate dello strato soprabasale. Sebbene la proteina E7 dei genotipi ad alto

58

rischio leghi i membri della famiglia Rb con una affinità più elevata di quella dei basso rischio, anche questi ultimi possono indurre la sintesi del DNA nelle cellule in fase di differenziamento [Cheng S. et al., 1995].

L’attivazione della fase produttiva del ciclo di vita di HPV coincide anche con l’ espressione ad alti livelli della proteina E4 [Doorbar J. et al. 1997], che si accumula nel citoplasma delle cellule più superficiali dell’epitelio pluristratificato. Sebbene il contributo della proteina E4 al ciclo di vita virale non sia ancora completamente chiaro, sembra che essa abbia un ruolo nell’indurre il collasso delle citocheratine di membrana e quindi favorisca il rilascio dei virioni neoformati mediante l’alterazione dell’integrità cellulare [Wang Q et al. 2004].

Un’altra proteina di HPV che viene espressa nelle cellule in fase di differenziamento è E5. Nel papillomavirus bovino (BPV), la proteina E5 è responsabile della maggiore attività trasformante del virus ma, nell’uomo, i meccanismi con cui essa media i suoi effetti sono ancora in fase di studio. Diversi studi in vitro hanno suggerito una relazione tra E5 ed il recettore per il fattore di crescita epidermico (EGFR), un recettore transmembrana presente su tutte le cellule epiteliali e potente fattore di crescita per fibroblasti e cheratinociti [Straight SW. et al. 1993].

La sintesi della progenie virale avviene negli strati terminali maggiormente differenziati dell’epitelio. Le proteine capsidiche L1 ed L2 vengono espresse in questi livelli solo dopo l’avvenuta amplificazione dei genomi virali che restano associati ad istoni cellulari formando complessi simil cromatinici. Il genomi virali vengono quindi inseriti in capsidi icosaedrici, ciascuno dei quali è costituito da 360 copie della proteina capsidica maggiore L1 e circa 12 copie della proteina capsidica minore L2 [Modis Y. et al. 2002]. Sebbene le particelle neoformate del virus riescano ad assemblarsi anche in assenza di L2, si crede che la sua presenza influenzi l’efficienza dell’impacchettamento e sia essenziale per la successiva infettività dei virioni [Okun MM. et al., 2001]. Una volta mature, i virioni fuoriescono dalla superficie dell’epitelio, ma il meccanismo ben preciso con cui questo avviene non è chiaro.