Clonaggio della sequenza target in pcDNA3-GFP

Per verificare l’efficienza di taglio della TALEN progettate, è stata clonata la sequenza target prescelta in un plasmide contenente la green fluorescent protein (GFP) come gene reporter, così da registrare una diminuzione della fluorescenza il seguito a taglio delle TALEN, se esse si legano in modo efficiente al sito target.

E’ stato utilizzato un plasmide commerciale, pcDNA3 (Fig. 4.5; Invitrogen, Carlsbad, California), in cui era stata precedentemente clonata la GFP sotto il controllo del promotore del Citomegalovirus. La sequenza target è stata clonata in due punti all'interno del plasmide, a monte e a valle della GFP, utilizzando NruI FastDigest e

SmaI FastDigest (Fermentas/ ThermoScientific). A causa delle estremità blunt prodotte

da entrambi gli enzimi, le reazioni di digestione sono state effettuate in successione.

Figura 4.5: Plasmide pcDNA3-GFP.

In evidenza la posizione degli enzimi utilizzati per il clonaggio della sequenza target

La sequenza target e è stata acquistata sotto forma di oligonucleotide (IDT, San Jose, California) e, per effettuare il successivo clonaggio in pcDNA3-GFP, sono state aggiunte, a monte e a valle (Fig. 4.6), le sequenze corrispondenti ai siti di taglio per gli enzimi NruI e SmaI, tramite PCR con primers contenenti i siti di taglio per i dati enzimi.

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Figura 4.6: Sequenza target fiancheggiata dai siti di restrizione

Per il clonaggio della sequenza target all'interno di pcDNA3-GFP si è utilizzato come primo enzima SmaI, in quanto possiede i siti di taglio in posizione più interna rispetto a quelli NruI. Sono state preparate due reazioni di digestione distinte, una per il prodotto di PCR contenente la sequenza target e una per il plasmide, successivamente è stata poi allestita la reazione di ligation. La miscela per la reazione di digestione del prodotto di PCR conteneva: Buffer FastDigest 10x, 1U di SmaI FastDigest (1U/μl) (tutto Fermentas/Thermoscientific), 1 μg di oligonucleotide e acqua distillata sterile per portare a volume finale di 20 μl. Il tutto è stato incubato in bagnetto a 37°C per 10 minuti ed in seguito l'enzima è stato inattivato a 65°C per 5 minuti. La reazione di digestione di pcDNA3-GFP è stata fatta avvenire insieme alla reazione di defosforilazione dell'estremità 5' del plasmide, così che il plasmide non si richiuda su se stesso (escludendo il frammento durante la reazione di ligation). La miscela di reazione conteneva: Buffer FastDigest 10x, 1 U di SmaI FastDigest (1 U/μl), 1 U di FastAP (1 U/μl) (tutto Fermentas/Thermoscientific), 2 μg di plasmide pcDNA3-GFP e acqua distillata sterile per portare a volume finale di 20µl. La reazione è stata incubata in bagnetto a 37°C per 10 minuti, l'enzima è stato poi inattivato a 75°C per 5 minuti. Il plasmide digerito e defosforilato è stato isolato su gel di agarosio all’1%. Nei pozzetti sono stati caricati simultaneamente 20 μl del prodotto digerito mescolato con Loading Buffer 10X (Fermentas/ThermoScientific) e 5 μl di DNA Ladder di 1 Kb (Fermentas/ThermoScientific). Il gel sottoposto ad un campo elettroforetico di 90 Volt per 30 minuti è stato successivamente osservato al transilluminatore e la banda corrispondente al plasmide linearizzato di circa 6 Kbp è stata estratta dal gel e poi purificata tramite PCR clean-up and gel extraction kits (Macherey-Nagel, Düren

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Per la reazione di ligation, le quantità di DNA vettore e di inserto necessarie sono state calcolate tenendo conto delle dimensioni relative dei due frammenti secondo la seguente formula (utilizzando una quantità fissa di vettore pari a 150ng):

Formula n. 1

La miscela di reazione comprendeva: T4 DNA Ligase Buffer 10X, 5 U di T4 DNA

Ligase (5 u/μl) (tutto Fermentas/ThermoScientific), 150 ng di pcDNA3-GFP digerito e

defosforilato, la quantità calcolata di inserto ed acqua distillata sterile per portare la soluzione a volume finale di 20µl. Il campione è stato incubato a 22°C per 30 minuti e poi inattivato a 65 °C per 10 minuti.

Con il prodotto della ligation son state trasformare le cellule batteriche competenti STbl2 (Promega) che garantiscono un'alta efficienza di trasformazione. Queste cellule sono prive sia della proteina rec A che del sistema di restrizione, così che il plasmide non venga digerito e non si ricombini con il genoma batterico. La trasformazione è stata effettuata incubando le cellule in ghiaccio per 30 minuti e in seguito aggiungendovi 10 μl del prodotto di ligation. Successivamente le cellule sono state sottoposte a shock termico, passandole velocemente dal ghiaccio al bagnetto a 42 °C per 45 secondi e poi nuovamente in ghiaccio per 3 minuti, così da facilitare l’ingresso del DNA plasmidico. Dopo ad aver aggiunto 1 ml di terreno SOC (2% Triptone, 0.5% di estratto di lievito, NaCl 10 mM, KCl 2.5 mM, MgSO4 10 mM, MgCl2 10 mM e glucosio 20 mM), la miscela è stata posta in agitazione a 30 °C per 1 ora, dopodiché si è centrifugata a 3000 rpm per 5 minuti. Il pellet batterico è stato quindi risospeso in 200 μl di terreno SOC e seminato su piastre Petri contenenti LB Agar (1% bacto-triptone, 0.5% di estratto di lievito, NaCl 1%, 1.5% agar batteriologico) ed ampicillina (Sigma Aldrich S. Louis, USA) alla concentrazione di 100 μg/ml, che ha permesso di selezionare le cellule contenti il plasmide (antibiotico-resistenti) da quelle che ne sono prive. Le piastre sono state poi incubate a 37 °C overnight. Il giorno successivo ciascuna colonia cresciuta sulla piastra è stata messa a crescere in agitazione in 3 ml di terreno liquido LB a 30°C overnight. Il mattino seguente sono stati prelevati

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600 μl di crescita batterica in un'eppendorf da 1,5 ml ed è stata eseguita l'estrazione del plasmide con il kit PureYield Plasmid Miniprep Sysyem (Promega). L’estrazione è stata verificata su gel di agarosio all’1% e la giusta dimensione valutata dal confronto con il marker (DNA Ladder di 1 Kb). Allo spettrofotometro abbiamo poi ricavato la concentrazione di DNA plasmidico ottenuta.

Per verificare l'effettivo clonaggio della sequenza target all'interno di pcDNA3- GFP (pcDNA3-GFP-1xDNAH11) è stata effettuata un'altra reazione di digestione, utilizzando BlpI FastDigest (Fermentas/ThermoScientific) che taglia esclusivamente all'interno della sequenza clonata. Per la reazione è stata preparata una miscela di 20 μl finali contenente Buffer FastDigest 10x, 1U di BlpI FastDigest (1U/μl), 1 μg di plasmide digerito e acqua sterile distillata a volume. La reazione è stata incubata nel bagnetto ad acqua a 37°C per 10 minuti e successivamente l'enzima è stato inattivato a 80°C per 5 minuti. Infine il campione è stato corso su gel d'agarosio all' 1% insieme a 5 μl di DNA Ladder di 1 Kb per verificare la presenza di un'unica banda di circa 6 Kb corrispondente al plasmide linearizzato.

Tutte le reazioni e i passaggi appena descritti sono stati ripetuti per il secondo clonaggio all’interno del vettore contenente il primo inserto, effettuato mediante l’enzima di restrizione NruI (FastDigest Fermentas/ThermoScientific). Per la verifica del secondo clonaggio è stata eseguita una reazione di digestione con BlpI FastDigest che, tagliando a metà l'inserto clonato nei due punti del plasmide (pcDNA3-GFP- 2xDNAH11), produce due frammenti di circa 2 Kb e 3 Kbp che sono stati visualizzati su gel d'agarosio all’1%.