Coltura cellulare e saggi su SH-SY5Y

Linea cellulare e mezzi di coltura. Per testare i substrati è stata impiegata la linea di

neuroblastoma umano SH-SY5Y (ATCC CRL-2266). Le cellule sono state propagate in fiasche T75 in condizioni proliferative, mediante Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)/F12 (Gibco) con aggiunta di siero fetale bovino 10% (FBS, Gibco), 100 U/ml penicillina (Gibco) e 100 μg/ml streptomicina (Gibco), in ambiente termostatato (37°C) ed arricchito di CO2 al 5%.

Arrivate a confluenza, le cellule sono state divise mediante procedure standard di trattamento in tripsina seguito da bloccaggio con terreno, centrifugazione e suddivisione della popolazione cellulare. Prima della semina, le cellule venivano contate mediate camera di Burker. Su ogni substrato le cellule sono state seminate ad una densità di 15000 cell/cm2

in condizioni proliferative.

Per quanto riguarda gli esperimenti di differenziamento cellulare, dopo 24 ore dalla semina in coltura in terreno proliferativo, quest'ultimo è stato sostituito con terreno differenziativo, costituito da DMEM (Gibco) con aggiunta di 1% FBS (Gibco), 10 μM acido

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trans-retinoico (Sigma Aldrich), 100 U/ml penicillina e 100 μg/ml streptomicina. Il terreno è stato sostituito dopo due giorni dall'induzione del differenziamento; al quinto giorno le colture sono state fermate e sottoposte ad analisi.

Saggio sui ROS con DCFH-DA. La misurazione dei ROS intracellulari prodotti nelle diverse

situazioni sperimentali (cellule coltivate su controllo, fibre random/allineate, con/senza nanoceria) è stata condotta in presenza ed in assenza di uno stimolo ossidativo (H2O2 100

μM per 30 minuti). I livelli di ROS prodotti dalle cellule sono stati analizzati mediante l'impiego di una sonda sensibile alle specie molecolari ossidanti, la 20,70- diclorofluoresceina diacetato (DCFH-DA, Invitrogen), in grado di produrre un segnale in fluorescenza direttamente proporzionale alla concentrazione di ROS presenti. La DCFH-DA è stata utilizzata in concentrazione 25 μM in mezzo DMEM/F12 senza rosso-fenolo (che interferirebbe con le misure) ed FBS, incubando le colture per 30 minuti a 37°C. Dopo il trattamento, è stato eseguito un lavaggio (30 minuti a 37°C) con mezzo di coltura al fine di allontanare la sonda residua. Infine è stato allontanato il mezzo e sono stati aggiunti 250 μl di acqua distillata MilliQ per procedere con la lisi cellulare, ottenuta sottoponendo le colture a 4 cicli di rapido congelamento-scongelamento. La soluzione di lisi è stata quindi analizzata mediante spettrofluorimetro (eccitazione 485 nm, emissione 535 nm; Victor3, Perkin Elmer), ponendo 60 μl di surnatante in piastre nere da 96 wells. Le letture sono state svolte in triplicato per ogni esperimento, svolto anch'esso in triplicato.

Saggio WST-1. Per i test di vitalità cellulare, le cellule sono state coltivate in terreno

proliferativo a 37°C ed analizzate a 1, 2 e 5 giorni dalla semina. Il test utilizzato è il WST-1, basato su un sale di tetrazolo, il (2-(4-iodofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-(2,4-disulfofenil)-2H- tetrazolio (sale monosodico, BioVision). Questo saggio sfrutta prevalentemente enzimi mitocondriali (la succinato deidrogenasi) per ridurre il sale di tetrazolo (giallo-arancio) a

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formazano (violaceo). La conversione di questo composto è proporzionale all’attività metabolica cellulare e quindi alla vitalità delle cellule.

Ad ogni punto temporale è stato sostituito il mezzo proliferativo con 300 μl di mezzo proliferativo privo di rosso-fenolo e con 30 μl di WST-1. Dopo 90 minuti di incubazione a 37°C il surnatante è stato trasferito nei pozzetti di una piastra da 96-well per la lettura spettrofotometrica. Le misurazioni sono state eseguite mediante l’uso di un lettore di piastre leggendo a 450 nm (Victor3, Perkin Elmer). Gli esperimenti sono stati svolti in triplicato ed i dati (media ± deviazione standard) mostrati in grafici Excel.

Colorazione in fluorescenza delle colture in proliferazione. La colorazione delle cellule

proliferate sui substrati è stata condotta per osservarne la morfologia e la disposizione lungo le fibre di gelatina. Marcando in rosso i filamenti di actina mediante falloidina-TRITC, (Sigma) una tossina che si lega saldamente all’F-actina citoscheletrica, è stata evidenziata la morfologia cellulare. I nuclei delle cellule sono stati invece colorati mediante un intercalante del DNA, l'Höchst, che emette forte fluorescenza nel blu una volta aver interagito con gli acidi nucleici. Dopo un rapido lavaggio in PBS le cellule sono state fissate per 20 minuti con paraformaldeide (PFA) 4% in PBS a 4°C. Quindi sono stati eseguiti 3 lavaggi di 5 minuti ciascuno con PBS prima di permeabilizzare le membrane aggiungendo il detergente Triton (0.1% in PBS) per 5 minuti. Al termine della permeabilizzazione si è aggiunto siero di capra (10% in PBS) per un'ora, per bloccare gli eventuali siti di interazione aspecifica, e quindi è stata condotta l'incubazione con falloidina-TRITC (diluita 1:100 in siero di capra 10%) per 1 ora a 37°C. Quindi si è proseguito con due lavaggi in PBS, un'incubazione con Höchst (1:1000 in PBS) per 15 minuti a 37°C, ed infine due ultimi lavaggi in PBS prima dell'osservazione al microscopio.

Colorazione in immunofluorescenza delle colture in differenziamento. Al termine del

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come descritto sopra. Al termine del bloccaggio in siero di capra è stata effettuata un'incubazione (1 ora, 37°C) con anticorpo IgG di coniglio contro β3-tubulina umana (1:75 in siero di capra 10%, Sigma). La β3-tubulina è una proteina citoscheletrica che rappresenta un marcatore di differenziamento neurale, localizzato sia lungo l’assone che all’interno del corpo cellulare, che permette quindi di identificare cellule con fenotipo neuronale. Al termine del trattamento con questo anticorpo primario si è proceduto a cinque lavaggi, di 4 minuti ciascuno, in siero di capra al 10% in PBS. E' stato quindi aggiunto l’anticorpo secondario, un IgG di capra anti-coniglio, coniugato con un fluoroforo verde (Alexa Fluor 488-IgG, Invitrogen) per 45 minuti a 37°C (1:250 in siero di capra 10%). La procedura di colorazione si è conclusa analogamente a quanto descritto in precedenza, con coloratura dei nuclei mediante Höchst ed estensivi lavaggi in PBS.

Le immagini in epifluoresceza sono state acquisite mediante un microscopio Eclipse Ti (Nikon); la microscopia confocale è stata condotta con un C2s (Nikon). La ricostruzione 3D delle singole acquisizioni confocali è stata eseguita mediante il software NIS Element Professional (Nikon).

Osservazione mediante microscopia elettronica. La preparazione dei campioni per le

osservazioni al microscopio elettronico a scansione (SEM, Dual Beam system FEI Helios 600) è stata svolta fissando le cellule cresciute sui substrati (sia per analisi in proliferazione, sia per analisi in differenziamento) con PFA al 4% per 30 minuti a 4°C. Successivamente si è allontanato il reagente con due lavaggi in acqua distillata MilliQ e si è svolto un secondo ciclo di fissaggio di 4 ore a 4°C utilizzando una soluzione di glutaraldeide (2.5% Sigma) diluita in acqua demineralizzata. A questo passaggio sono seguiti due lavaggi in acqua demineralizzata, prima di una disidratazione progressiva dei campioni in gradiente crescente di etanolo (soluzioni 25%, 50%, 75%, 100%). Ogni incubazione con le soluzioni di etanolo è stata condotta per 5 minuti, 2 volte. Al termine della procedura i

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campioni sono stati lasciati evaporare completamente prima della deposizione di un sottile strato d'oro mediate sputtering (70 W, 8 secondi), al fine di consentirne la visualizzazione mediante SEM.