Guida e accrescimento assonale

Immunocitochimica e acquisizione al SEM di cellule in differenziamento. Figura 10

riporta immagini in fluorescenza delle colture cellulari dopo 5 giorni di differenziamento neuronale. In verde è stata evidenziata l'espressione di β3-tubulina. Sono chiari, già a

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livello qualitativo, gli effetti dei substrati sul fenotipo cellulare. L'espressione del marcatore neuronale è infatti più intensa in tutti i substrati rispetto al controllo. Inoltre, è altresì evidente la forte polarizzazione dei neuriti nella direzione dell'asse delle fibre, nel caso di colture su substrati allineati.

Figura 10. Marcatura della β3-tubulina in cellule sottoposte ad induzione del differenziamento dopo cinque giorni.

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In Figura 11a sono mostrati i risultati dell'analisi quantitativa dell'orientamento dei neuriti nelle colture cellulari differenziate sulle diverse tipologie di substrato. Come riportato, per quanto riguarda i substrati costituiti da fibre allineate i valori misurati sono 13.4 ± 2.2°, mentre per i substrati costituiti da fibre allineate con nanoceria 12.0 ± 2.5°. Le altre tipologie di substrati mostrano invece una situazione di orientamento assonale casuale, dovuta all'isotropia della superficie (“controllo”, 41.4 ± 5.0°, “random”, 52.0 ± 6.0°, e “random + NC”, 46.2 ± 2.9°). Le analisi statistiche sono state svolte con il Kruskal-Wallis test seguito dal Wilcoxon post-hoc test con la correzione di Holm.

Figura 11. Allineamento e lunghezza assonale. I dati sono riportati in box-plot descriventi la mediana con intervallo di confidenza di ± 95%

Estremamente interessanti sono i dati riguardanti la lunghezza dei neuriti (Figura 11b). E’ stato infatti evidenziato come le cellule differenziate su substrati contenenti nanoceria (sia con struttura random che allineata), mostrano neuriti significativamente più lunghi rispetto alle cellule differenziate su substrati di semplice gelatina e sulla superficie di controllo. Inoltre, il confronto per categoria topografica mostra un significativo incremento

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della lunghezza sui substrati "allineati" rispetto a quelli "random", a prescindere dalla presenza di nanoceria. Anche in questo caso le analisi statistiche sono state condotte mediante l’uso del Kruskal Wallis test, seguito dal Wilcoxon post-hoc test con correzione di Holm.

E' possibile pertanto concludere come esista un ruolo sinergico della topografia del substrato e della presenza delle nanoparticelle a determinare un significativo miglioramento del fenotipo neuronale, in termini di lunghezza dei neuriti sviluppati.

Figura 12. Immagini SEM delle colture cellulari dopo 5 giorni di differenziamento sulle diverse tipologie di substrato analizzate.

Le Figure 12 e 13 mostrano, rispettivamente, acquisizioni SEM ed in microscopia confocale delle colture differenziate sui diversi substrati, che corroborano qualitativamente i risultati quantitativi derivanti dall'analisi delle immagini in fluorescenza appena descritta. Più in dettaglio, le immagini confocali sono il risultato di una ricostruzione 3D di acquisizioni multiple lungo l'asse z. In rosso è marcata l'F-actina, in verde la β3-tubulina ed in blu i nuclei. Anche in questo caso è evidente il trend di espressione di β3-tubulina, indice di una

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maggiore maturazione del fenotipo neuronale (Hau et al., 2008). Sia le immagini SEM che quelle confocali mostrano ancora una volta la forte polarizzazione dei copri cellulari e dei neuriti nella direzione delle fibre, nel caso di substrati "allineati".

Figura 13. Ricostruzione 3D di acquisizioni confocali di SH-SY5Y dopo 5 giorni di differenziamento sulle diverse tipologie di substrato analizzate. In verde β3-tubulina, in rosso F-actina, in blu i nuclei.

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4. Discussione

Promuovere una corretta ricrescita assonale è un traguardo ambito in medicina rigenerativa. Le cellule nervose per orientarsi rispondono a numerosi segnali: oltre a stimolazioni di tipo chimico, esse vengono indirizzate percependo stimoli di tipo fisico. La topografia di un substrato può promuovere l’adesione cellulare, la crescita assonale, l’allineamento, e cambiamenti morfologici grazie a fenomeni di meccano-trasuzione. Da ciò ne consegue che la risposta neuronale alla topografia di un ambiente di crescita è un fenomeno estremamente complesso che coinvolge numerosi fattori (Hoffman et al., 2010). L’idea alla base di questo lavoro di Tesi mira alla realizzazione di una tipologia di scaffold biodegradabile, biocompatibile e che possieda due proprietà importanti dal punto di vista dell’ingegneria tissutale: l'indirizzamento della rigenerazione e della crescita assonale tramite una stimolazione topografica e la protezione delle cellule in differenziamento da un ambiente pro-ossidante avverso. Queste proprietà sono state ottenute nei substrati analizzati "drogando" scaffold elettrofilati in gelatina con nanoparticelle di ossido di cerio, dalle spiccate proprietà antiossidanti auto-rigeneranti. Gli effetti delle strutture così ottenute sono stati testati una linea di neuroblastoma umano, le cellule SH-SY5Y, ampiamente utilizzate come modello neuronale.

L’organizzazione topografica del substrato risulta di fondamentale importanza, infatti a livello dei coni di crescita dei neuroni sono presenti meccanocettori in grado di riconoscere gli stimoli fisici dell’ambiente di crescita (Chua et al., 2014; Pellegrini et al., 2001; Pellegrino et al., 2011) e di trasdurli in comportamenti cellulari ben definiti. Si è scoperto ad esempio come vengano attivati pathway per la meccanotrasduzione del segnale, fra cui la risposta alla fosforilazione delle proteine di adesione focale, portando le cellule a profondi riarrangiamenti citoscheletrici e deformazioni nucleari (Hoffman et al., 2010). La presenza di superfici micro-nano strutturate promuove inoltre l’adesione del cono di

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crescita al substrato, consentendo lo sviluppo di una forza di tensione necessaria all’allungamento assonale (Marino et al., 2013).

Data la rilevanza dell’organizzazione superficiale, i substrati analizzati in questa Tesi sono stati esaminati mediante SEM e successiva analisi mediante fast Fourier transform (FFT) al fine di dimostrarne l'elevata anisotropia, data da un forte allineamento delle fibre di gelatina. Per quanto riguarda le proprietà antiossidanti, queste sono state chiaramente evidenziate in quei substrati dove sono state inserite le nanoparticelle di ossido di cerio. In un lavoro simile (Mandoli et al., 2010) la nanoceria è stata inserita in uno scaffold in acido poli(lattico-co-glicolico), dimostrando un aumento di proliferazione di cellule staminali cardiache e mesenchimali murine rispetto alle stesse cellule cresciute su substrati di semplice acido poli(lattico-co-glicolico). Nel nostro lavoro, al contrario, abbiamo trovato un decremento della proliferazione cellulare dopo 5 giorni di coltivazione delle cellule in condizioni proliferative, accompagnato però da un miglioramento dei processi differenziativi e dalle difese dalle specie reattive dell’ossigeno. Probabilmente la differenza osservata dai nostri esperimenti rispetto al lavoro di Mandoli et al. è ascrivibile al diverso modello cellulare utilizzato. Il ruolo pro-differenziativo e protettivo della NC sulle SH-SY5Y, dimostrato dai nostri esperimenti, replica il comportamento osservato su cellule simil-neuronali PC12 (Ciofani et al. 2013), dove era stata dimostrata la promozione della maturazione neuronale verso un destino dopaminergico, accompagnata da un sostanziale decremento dei livelli di ROS. Questi effetti protettivi sono stati dimostrati anche attraverso un secondo lavoro di Ciofani et al. 2013 che prendeva in considerazione anche l'analisi dell’espressione di un pool di 84 geni coinvolti in vario modo nella difesa da stress ossidativo, nel metabolismo dei ROS, e nel trasporto dell’ossigeno: ben 16 di questi geni modificano sostanzialmente la loro espressione nelle cellule trattate con nanoceria.

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Un ulteriore lavoro in cui viene rilevato l’effetto pro-differenziativo indotto dalla presenza di NC aggiunta agli scaffold riguarda un modello cellulare di staminali mesenchimali umane, le quali coltivate su substrati a base di silicio, riescono a differenziare in osteoblasti (Karakoti et al., 2010). L’effetto differenziativo pro-osteogenico delle cellule staminali mesenchimali non è stato rilevato sugli stessi substrati di silicio privi di nanoparticelle di ossido di cerio.

Studi in vitro hanno dimostrato che la NC riesce ad indurre proliferazione cellulare, formazione di nuovi vasi sanguigni e l’espressione di importanti fattori proliferativi e pro- angiogenetici come l’HIF1-α e VEGF in cellule endoteliali umane (Das et al., 2012). E’ stato dimostrato che il VEGF stimola la ricrescita assonale (Sun et al., 2003). Dal punto di vista dell’ingegneria tissutale questo ci può far ipotizzare che in un tessuto sottoposto a trauma e lesione nervosa, la presenza di nanoceria negli scaffold potrebbe indurre un ulteriore effetto pro-rigenerativo anche grazie alla cooperazione di molecole bioattive come il VEGF prodotte da altri sistemi cellulari. Questa interessante ipotesi sulla sinergia tissutale indotta dalla NC è degna di approfondimento, e dai risultai sperimentali in vitro appare promettente.

Tornando alla stimolazione topografica, è interessante sottolineare gli effetti anche sulla conformazione dei nuclei cellulari. Quando si assiste alla polarizzazione del nucleo, conseguenza dell’addensamento della cromatina, è in atto un profondo cambiamento nell’espressione genica che ha come ultimo effetto un cambiamento del fenotipo cellulare (Versaevel et al. 2012). Questo fenomeno è stato da noi osservato nelle cellule cresciute sui substrati costituiti da fibre allineate, dove si può apprezzare non solo la polarizzazione dei corpi cellulari, ma anche l’allineamento dei nuclei lungo la direzione delle fibre, caratteristica che fa ipotizzare l’inizio degli eventi di meccanotrasduzione del segnale che portano ad un miglioramento del fenotipo neuronale.

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Con gli scaffold testati nel presente lavoro di tesi siamo riusciti a combinare l’effetto protettivo e pro-differenziativo esercitato dalla NC sulle cellule neuronali all’effetto topografico del substrato, capace di indirizzare ed incrementare la crescita assonale. Le cellule cresciute sui substrati a fibre allineate con l’aggiunta di NC risultano ben polarizzate, allineate all'asse delle fibre, e mostrano un sostanziale miglioramento del fenotipo neuronale in termini di di lunghezza dei neuriti rispetto alle altre tipologie di substrato prese in esame.

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5. Conclusioni

In questo lavoro di Tesi è stato studiato l'effetto di scaffold elettrofilati in gelatina, addizionati con nanoparticelle di ossido di cerio, sull'organizzazione ed il differenziamento neuronale della linea cellulare modello SH-SY5Y.

I risultati hanno dimostrato l'efficienza dei substrati nel promuovere l'accrescimento assonale in una direzione preferenziale, ed il ruolo protettivo, antiossidante e pro- differenziativo delle nanoparticelle inserite nelle fibre dei substrati.

L'azione sinergica topografia + "smart materials" si è rilevata una strategia vincente per la realizzazione di substrati nonocompositi, che risultano ottimi candidati per applicazioni di ingegneria tissutale e medicina rigenerativa, in particolar modo per quanto riguarda la riparazione e la rigenerazione di lesioni dei nervi periferici. Le evidenze sperimentali raccolte sono promettenti, ed incoraggiano futuri studi in vivo e traslazionali dell'approccio proposto.

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