Gli effetti tossici dell’OTA sono legati alle sue proprietà elettrochimiche, ovvero alla capacità della molecola di ossidarsi e portare alla formazione di specie chinoniche. I metodi elettrochimici per la determinazione della tossina sfruttano proprio tali proprietà.
In particolari condizioni, in presenza di FeTTPS e , l’OTA si ossida a OTQ (chinone) che a sua volta in presenza di ascorbato di sodio si riduce a OTHQ (idrochinone) (Calcutt et al., 2001).
Figura 25: struttura dell’OTA (1), OTHQ (2) e OTQ (3) (Calcutt et al., 2001).
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Relativamente alle proprietà elettrochimiche dell’OTA sono stati effettuati molti studi negli anni e rilevanti sono stati quelli di Calcutt e collaboratori nel 2001 e di Oliveira e
collaboratori nel 2007. In entrambi è stata utilizzato come metodo elettrochimico la
voltammetria, in particolare la voltammetria CV, DPV, SWV e RDV (a disco rotante), per analizzare soluzioni costituite da OTA ed elettroliti a differenti valori di pH.
Calcutt e collaboratori hanno analizzato il comportamento elettrochimico dell’OTA
usando la voltammetria CV e la voltammetria RDV. Nel primo caso hanno utilizzato una cella elettrochimica costituita da:
- elettrodo di lavoro in grafite vetrosa
- elettrodo di riferimento a filo di platino o argento - elettrodo ausiliario di platino.
La cella RDV, invece, era costituita da:
- elettrodo di lavoro a disco rotante in grafite vetrosa - elettrodo di riferimento in calomelano saturo - elettrodo ausiliario in filo di platino.
Hanno osservato il comportamento dell’OTA in acetonitrile (MeCN) e in tampone fosfato. In acetonitrile l’OTA subiva un’ossidazione irreversibile. Come è mostrato nella figura 27, al primo ciclo e alla scansione diretta in acetonitrile si osserva un solo picco di ossidazione / pari a 1.81V. Alla scansione inversa, invece, si rileva un picco di riduzione pari a 0,58V. In corrispondenza del primo picco si ha l’ossidazione dell’OTA a OTQ mentre in corrispondenza del secondo picco si ha la riduzione di OTQ a OTHQ. Si parla di processo irreversibile poiché i valori del potenziale di ossidazione e di riduzione non coincidono. Al secondo ciclo si è osservato, inoltre, un potenziale di ossidazione pari a 1,38V corrispondente all’ossidazione dell’OTHQ.
Figura 27: voltammogramma CV dell’OTA in acetonitrile con velocità di scansione / 0,100 203 .
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Il comportamento dell’OTA in acetonitrile è stato confrontato con quello di un altro composto fenolico, 4-clorofenolo (4-ClPhOH). Anche nel caso del 4-ClPhOH è stato dimostrato che va incontro ad un processo di ossidazione irreversibile con al primo ciclo e alla scansione diretta / di 1,59V e alla scansione inversa di 0,50V. Al secondo ciclo, invece, si ottiene di 1,28V.
Figura 28: voltammogramma CV del 4-ClPhOH in acetonitrile con / 0,500 203 .
Riduzione: da OTQ a OTHQ ( =0,58V)
Ossidazione dell’OTHQ ( =1,38V)
Ossidazione: da OTA a OTQ ( / =1,81V)
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Sia nel caso dell’OTA che nel caso del 4-ClPhOH, / incrementa di 60mV ogni volta che / aumenta di 10 volte e l’ampiezza della corrente di picco anodico aumenta linearmente con / / .
È stata notata, quindi, una correlazione tra il comportamento elettrochimico dei due composti. Questo a dimostrare che la parte elettrochimicamente attiva della molecola dell’OTA sia il para-clorofenolo.
In questo studio Calcutt e collaboratori analizzano anche il comportamento elettrochimico della forma deprotonata dell’OTA, 4-3. In acetonitrile si ottengono i seguenti dati:
- primo ciclo e scansione diretta: / =1,0V
- primo ciclo e scansione inversa: nessun picco di riduzione. Assenza della coppia redox OTHQ/OTQ.
Questi risultati sono dovuti al fatto che dall’ossidazione dell’ 4-3, che coinvolge un elettrone e un protone, si ottengono specie radicaliche. L’ossidazione di quest’ultime, inoltre, porta alla formazione del catione fenossonio.
Figura 29: voltammogramma CV dell’ 4-3 in acetonitrile con / 0,100 203 .
Riduzione: da BQ a benzoidrochinone, BHQ ( =0,50V) Ossidazione: da 4-ClPhOH a benzochinone, BQ ( / =1,59V) Ossidazione di BHQ ( =1,28V)
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Figura 30: processo ossidativo dell’ 4-3.
È stato osservato anche il comportamento della forma deprotonata del 4-ClPhOH, 4 6ℎ 3, ed è stato notato che questa molecola mostra gli stessi risultati dell’ 4-3,
ovvero il solo picco di ossidazione al primo ciclo e alla scansione diretta ( / =0,74V), e assenza della formazione della coppia redox.
Figura 31: voltammogramma CV del 4 6ℎ 3 in acetonitrile con / 0,100 203 .
Ossidazione dell’ 4-3 ( / =1,0V)
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Oltre a studiare il comportamento di questi composti in acetonitrile è stato studiato anche in tampone fosfato. È stato visto che i dati relativi all’OTA in tampone fosfato sono molto simili a quelli ottenuti per l’ 4-3 in acetonitrile poiché in condizioni di pH fisiologico l’OTA si deprotona. I valori dei potenziali sono i seguenti:
- al primo ciclo e alla scansione diretta: / =0,80V
- al primo ciclo e alla scansione inversa: =0,1V.
Dunque anche in questo caso si parla di ossidazione irreversibile e assenza della coppia redox OTHQ/OTQ.
Figura 32: voltammogramma CV dell’ 4- in tampone fosfato con / 0,100 203 .
Ossidazione del 4 6ℎ 3(
/ =0,74V)
/ =0,80V
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I dati ottenuti in acetonitrile e in tampone fosfato sono importanti per comprendere il destino metabolico dell’OTA. Infatti gli enzimi ligninasi e perossidasi, essendo attivi a valori di potenziale troppo bassi rispetto a quelli che consentono l’ossidazione della forma protonata, determinano l’ossidazione della forma deprotonata generando le forme radicaliche. L’enzima CYP450, invece, è in grado di convertire l’OTA nelle specie chinoniche.
Lo studio di Oliveira e collaboratori approfondisce anch’esso il comportamento elettrochimico dell’OTA. La cella elettrochimica utilizzata è composta da:
- elettrodo di lavoro in carbonio vetroso - elettrodo di riferimento in argento - elettrodo ausiliario in platino.
Le tecniche elettrochimiche applicate sono la voltammetria CV, DPV e SWV e hanno permesso di capire che l’ossidazione dell’OTA in condizioni alcaline è indipendente dal pH della soluzione mentre in condizioni di pH inferiore a 7 è dipendente da esso. Infatti nel primo caso l’OTA, in concentrazione di 500 8, si deprotona originando, con l’applicazione della voltammetria CV, un picco 1 con =0,88V, un valore indipendente dal pH della soluzione. Nel secondo caso, invece, alla scansione inversa si ottiene un secondo picco, 2 , il cui valore dipende dal pH. In particolare è stato studiato il comportamento dell’OTA, sempre alla concentrazione di 500 8, in presenza di tampone fosfato e acetato. In presenza di tampone fosfato, 0,2M e pH=7, si ottiene al primo ciclo e alla scansione diretta un picco 1 con =0,88V e alla scansione inversa un picco 2 con =0,22V. Successivamente al secondo ciclo si ottiene un picco 2 con =0,26V. I valori ottenuti ci indicano la reversibilità del picco 2 . Nel caso del tampone acetato, 0,2M e pH=4, si ottiene al primo ciclo e alla scansione diretta un picco 1 con =1,09V e alla scansione inversa un picco 2 con =0,34V. Al secondo ciclo di osserva un solo picco 2 con =0,67V. In questo caso non si forma la coppia redox reversibile.
Sempre nel caso del tampone acetato ma con una concentrazione minore dell’OTA, 50 8, si osserva al secondo ciclo un picco 2 con =0,46V e quindi si parla di formazione della coppia redox reversibile. Appare, inoltre, al terzo ciclo un picco 3 con
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Figura 33: voltammogramma CV in tampone fosfato (B), in tampone acetato (C) con concentrazione dell’OTA di 500 8 e in tampone acetato (D) con concentrazione dell’OTA di 50 8. In tutte e tre i casi la / 0,200 203 .
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L’influenza del pH, inoltre, è studiata usando la voltammetria DPV e considerando un range di pH tra 2-12. L’OTA è considerata alla concentrazione di 50 8 in soluzioni con differenti elettroliti 0,2M.
Nel caso di pH tra 2-7 il valore del potenziale di picco è spostato verso valori più bassi con l’innalzamento del pH secondo la formula: :2 =1,126-0,063pH. Esprimendo il potenziale di picco in funzione del pH la pendenza è pari a 63mV per unità di pH, ovvero il processo di ossidazione avviene sempre con la perdita dello stesso numero di elettroni e protoni e siccome in tutti gli elettroliti l’ampiezza della metà del picco di ossidazione dell’OTA 1 è ;/ =88mV, allora il processo di ossidazione avviene con il trasferimento di un elettrone e un protone. Inoltre è notato che la corrente di picco < aumenta con il pH raggiungendo un picco tra 4-5. Questi risultati sono dovuti al fatto che il processo di ossidazione coinvolge il trasferimento di un solo elettrone e protone.
Figura 34: potenziale di picco (A) e corrente di picco (B) in funzione del pH.
Per pH>7 il valore del potenziale di picco non dipende dal pH e il processo di ossidazione coinvolge il trasferimento di un solo elettrone.
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Nel caso di una soluzione costituita da 5 8 di OTA e tampone acetato, 0,2M e pH=4, il voltammogramma DPV ottenuto mostra al primo ciclo =1,10V, al secondo =0,41V e al terzo ciclo , =0,87V. La corrente di picco 1 diminuisce con le successive scansioni per la diminuzione dell’area disponibile dell’elettrodo per l’assorbimento dei prodotti di ossidazione dell’OTA. Infatti dopo numerose scansioni è necessario lavare l’elettrodo con un getto d’acqua deionizzato.
Nel caso di una soluzione costituita da 5 8 di OTA e tampone fosfato, 0,2M e pH=7, i risultati sono i seguenti: =0,80V e =0,24V. Anche in questo caso l’ampiezza della corrente in corrispondenza del primo picco diminuisce gradualmente con il numero delle scansioni a causa dell’assorbimento dei prodotti di ossidazione dell’OTA sulla superficie dell’elettrodo mentre quella del secondo picco rimane costante. È stato visto, inoltre, che l’intensità dell’assorbimento dei prodotti di ossidazione dell’OTA sull’elettrodo è di minor intensità nei mezzi alcalini rispetto a quelli acidi.
In voltammogrammi registrati in soluzioni con 5 8 di OTA in differenti elettroliti si è visto che il picco 2 si forma solo nel caso di elettroliti con pH inferiore a 8.
Figura 35: potenziale di picco in funzione del pH.
Il potenziale di questo picco è spostato verso valori più negativi con l’aumentare del pH. La pendenza del grafico con il potenziale di picco 2 in funzione del pH è di 57mV per unità di pH e quindi anche in questo caso il processo di ossidazione coinvolge lo stesso numero di elettroni e protoni.
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In tutti gli elettroliti l’ampiezza della metà del picco 2 è ;/ =50mV, quindi il processo di ossidazione dell’OTA si verifica con il trasferimento di due elettroni e di due protoni.
Inoltre si osserva che il picco 3 appare per elettroliti con pH inferiore a 6 e per valori più alti questo picco tende ad unirsi con il picco 1 . La dipendenza del potenziale di picco 3 dal pH è lineare e corrisponde a 38mV per ogni unità di pH. Questo significa probabilmente il trasferimento di un elettrone.
Per quanto riguarda la voltammetria ad onda quadra, infine, è stata presa in considerazione una soluzione con 10 8 di OTA in tampone acetato, 0,2M e pH=4. I risultati ottenuti sono: =0,80V, =0,45V, la cui ampiezza diminuisce con il numero delle scansioni, e , =0,92V.
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