In questo settore, il gruppo di ricerca presso il quale ho svolto il mio lavoro di tesi si è occupato della sintesi di diversi tipi di scaffold per nuovi agenti antitumorali, ponendo particolare attenzione alla realizzazione di nuovi sistemi eteropoliciclici planari o pseudoplanari, in alcuni casi caratterizzati dalla presenza di una catena basica di lunghezza variabile.
Recentemente queste ricerche hanno avuto come obbiettivo la sintesi del nuovo sistema tetraciclico benzotiopiranoindolico, (FIGURA 10), caratterizzato dalla presenza di sostituenti quali cloro e/o gruppo metossilico nelle posizioni 3 e 7 del sistema cromoforo; inoltre l’azoto indolico ha permesso la funzionalizzazione con catene alifatiche basiche che, come ampiamente riportato in letteratura e già verificato in altri sistemi policiclici, sono in grado di favorire la formazione del complesso di intercalazione. [42]
Figura 10: Struttura generale benzotiopiranoindolo
L’attività antiproliferativa dei nuovi derivati è stata valutata attraverso il monitoraggio in vitro dell’inibizione della crescita di due linee di cellule tumorali: HeLa (adenocarcinoma della cervice uterina) ed HL-60 (leucemia promielocitica umana).
35
I risultati di tali saggi sono espressi in valori di IC50, in concentrazione di µM, cioè
la concentrazione (μM) del composto testato che induce il 50% di riduzione del numero delle cellule rispetto a colture di riferimento e utilizzando come standard la ellipticina. [45]
I risultati ottenuti, riportati in Tabella I, hanno dimostrato che i cromofori di base (1a-d), indipendentemente dal gruppo sostituente R e R1 in posizione 7 o 3, non
presentano attività antiproliferativa. L’inserimento della catena basica dialchilamminoalchilica in posizione 11 è risultato cruciale per ottenere i composti attivi (1e-v), nei quali risulta invece più sfumato il ruolo dei sostituenti in posizione R e R1. In particolare il composto 1e avente un atomo di idrogeno in
posizione 3 e un gruppo metossilico (-OCH3) in 7 ha un IC50 inferiore al composto
36
Tabella I
Studi mediante dicroismo lineare in flusso (LD) hanno evidenziato che tutti i composti attivi sulle linee cellulari sono in grado di intercalarsi fortemente nel
Comp. R R1 R2 Linee cellulari IC50 (μM)
HL-60 HeLa 1a OCH3 H H > 20 > 20 1b OCH3 OCH3 H > 20 > 20 1c OCH3 Cl H > 20 > 20 1d Cl H H > 20 > 20 1e OCH3 H (CH2)2N(CH3)2 0.41 ± 0.08 1.30 ± 0.10 ±0 1f OCH3 H (CH2)2N(C2H5)2 1.80 ± 0.06 2.70 ± 0.05 1g OCH3 H (CH2)3N(CH3)2 1.90 ± 0.08 2.90 ± 0.3 1h OCH3 H (CH2)3N(C2H5)2 2.40 ± 0.08 3.90 ±0.6 1i OCH3 OCH3 (CH2)2N(CH3)2 0.66 ± 0.17 2.15 ± 0.50 1l OCH3 OCH3 (CH2)2N(C2H5)2 1.10 ± 0.06 2.30 ± 0.40 1m OCH3 OCH3 (CH2)3N(CH3)2 1.35 ± 0.10 2.60 ± 0.30 1n OCH3 OCH3 (CH2)3N(C2H5)2 1.50 ± 0.12 2.50 ± 0.30 1o OCH3 Cl (CH2)2N(CH3)2 1.17 ± 0.12 1.82 ± 0.87 1p OCH3 Cl (CH2)2N(C2H5)2 0.71 ± 0.09 1.12 ± 0.20 1q OCH3 Cl (CH2)3N(CH3)2 1.07 ± 0.24 1.85 ± 0.21 1r OCH3 Cl (CH2)3N(C2H5)2 1.02 ± 0.18 1.68 ± 0.25 1s Cl H (CH2)2N(CH3)2 1.31 ± 0.17 1.53 ± 0.24 1t Cl H (CH2)2N(C2H5)2 3.21 ± 0.39 4.33 ± 0.80 1u Cl H (CH2)3N(CH3)2 7.19 ± 0.69 14.05 ± 1.76 1v Cl H (CH2)3N(C2H5)2 2.64 ± 0.60 2.91 ± 0.11 Ellipticina 0.66 ± 0.02 0.29 ± 0.01
37
DNA, come evidenziato dallo spettro LD (FIGURA 11)[42], dove sono riportati i composti dal 1a e 1e-h.
wavelength (nm) 250 300 350 400 450 LD (deg) -0.025 -0.020 -0.015 -0.010 -0.005 0.000 DNA 1a 1e 1f 1g 1h 1a 1e 1h 1g 1f Figura 11.[42]
Misurazioni nella regione di assorbimento del DNA (260 nm) rivelano infatti un segnale negativo, mentre, in presenza dei nuovi composti benzotiopiranoindolici, si verifica un ulteriore segnale negativo a valori di lunghezza d’onda maggiori.
Il segnale negativo risulta praticamente assente per il sistema cromofoforo 1a, privo della catena laterale protonabile. I risultati estrapolati suggeriscono che il tetraciclo cromoforo si inserisce tra le paia di basi e questa sua capacità viene
38
incrementata dalla presenza della catena dialchilamminoalchilica, in particolare quella dimetilamminoetilica. Ciò è giustificato dalla presenza dell’azoto basico, protonabile a pH fisiologico, che facilita l’interazione tra gli acidi nucleici e il composto carico. Titolazioni fluorimetriche effettuate in presenza di DNA ed acidi polideossiribonucleici, caratterizzati da differenti composizioni di basi (poli GC o poli AT), hanno dimostrato che i composti in esame si legano con alta specificità alle sequenze di tipo AT. Studi di docking molecolare hanno permesso un approfondimento delle modalità di legame dei composti al DNA ed hanno confermato il ruolo essenziale delle catene di tipo basico nell’attività citotossica. Il modello generato conferma pienamente i dati sperimentali di binding sopra esposti, evidenziando un sito di interazione ionica tra i gruppi fosfato della doppia elica con la forma protonata della catena dialchilaminoalchilica, che, collocandosi selettivamente nel solco minore, costituisce il “sistema di ancoraggio” al DNA; sono inoltre evidenti estese interazioni di tipo π-π tra il sistema cromoforo e due coppie di basi consecutive, che confermano il legame di intercalazione nella doppia elica (figura 12). [42]
Figura 12.[42]
Come già ampiamente discusso, le DNA topoisomerasi sono state riconosciute come il bersaglio di molti farmaci antitumorali, inclusi gli intercalatori del DNA.
39
La capacità dei benzotiopiranoindoli di formare un complesso con il DNA suggerisce che l’effetto antiproliferativo riscontrato in questi composti potesse derivare anche dalla capacità di interferire con gli enzimi nucleari, appunto le topoisomerasi.
Sulla base di ciò è stato valutato l’effetto di alcuni composti più attivi in un saggio sulla capacità di rilassamento della topoisomerasi II su plasmidi superavvolti di pBR322 DNA.
In primo luogo, è stato saggiato il composto più attivo 1e, che si è dimostrato capace di inibire l’attività catalitica dell’enzima in modo dose-dipendente; inoltre, l’effetto ottenuto a concentrazione 5 µM di 1e è risultato paragonabile a quello esercitato da un ben noto inibitore della Topoisomerasi II, m-AMSA, utilizzato ad una concentrazione di 8 µM (FIGURE 13 e 14).
m-AMSA
40
Figura 14. [42]
Successivamente è stato valutato come, le differenti catene amminoalchiliche, contribuiscono alla citotossicità in funzione della loro lunghezza e ingombro sterico. In particolare è stata saggiata la capacità dei composti 1e-h (riportati in tabella I) di interagire con l’attività catalitica dell’enzima Topo II. I risultati hanno indicato che l’effetto inibitorio sull’enzima è variamente modulato dalle caratteristiche della catena, con un andamento pienamente in accordo con l’effetto antiproliferativo. Infine, data l’analogia strutturale di questi composti con l’inibitore Topo I/II duale Intoplicina [25], caratterizzato da un sistema cromoforo di tipo lineare contenente il nucleo indolico, è stata valutata la capacità del derivato più attivo 1e di interferire con l’attività Topo-I-mediata di rilassamento del DNA, ottenendo evidenti risultati positivi già alla dose di 10 µM.
La significativa attività antiproliferativa di questa serie di composti ed il loro interessante profilo nei confronti degli enzimi Topoisomerasi hanno giustificato lo sviluppo di due nuove serie di prodotti analoghi, sono quindi stati sintetizzati i derivati benzotiopiranoindolici, di formula generale II. In questi il gruppo metossilico (che ha mostrato di potenziare l’attività dei composti della serie
41
saggiati precedentemente) è stato spostato dalla posizione 7 alla posizione 3 del sistema cromoforo. Inoltre, in alcuni di questi derivati è stato aggiunto un ulteriore gruppo metossilico in posizione 2 (X'' = OCH3). Parallelamente, sono
stati preparati i derivati isosteri piridotiopiranoindolci III; in questo caso l’introduzione, direttamente nel sistema cromoforo, di un eteroatomo protonabile a pH fisiologico, potrebbe fornire un ulteriore o alternativo punto di ancoraggio nella formazione del complesso di intercalazione. [24]
II III
Figura 15.
L’attività citotossica e il meccanismo d’azione dei nuovi composti sintetizzati è stata valutata, in collaborazione con un gruppo di ricerca del dipartimento di Farmacia dell’università Padova. È stata fatta una valutazione dell’attività antiproliferativa, attraverso studi in vitro su linee cellulari tumorali umane rappresentative per diversi tipi di tessuto: HeLa (adenocarcinoma della cervice uterina), A-431 (carcinoma squamoso) e MSTO-211H (mesotelioma bifasico). I dati di tossicità sono espressi come valori IC50, utilizzando l’Ellipticina come
sostanza di riferimento.
Dai risultati biologici, finora disponibili, è stato estrapolato che i composti saggiati sono in grado di esercitare una significativa attività antiproliferativa,
42
caratterizzata da valori di IC50 sempre inferiori a 5µM, su tutte le linee cellulari.
(Tabella II).
Tabella II
N Y X X’ X” R HeLa A431 MSTO-211H
2g CH Cl OCH3 OCH3 (CH2)2N(CH3)2 3.5±0.4 3.2±0.6 1.8±0.6 2h CH Cl OCH3 OCH3 (CH2)2N(C2H5)2 4.6±0.4 2.2±0.8 2.4±0.5 2i CH Cl Cl H (CH2)2N(CH3)2 2.66±0.74 1.76±0.68 1.64±0.55 2l CH Cl Cl H (CH2)2N(C2H5)2 4.31±1.15 3.29±1.71 2.99±0.11 3e CH Cl OCH3 H (CH2)2N(CH3)2 2.79±0.95 2.76±0.46 2.96 0.05 3f CH Cl OCH3 H (CH2)2N(C2H5)2 3.21 ±0.26 5.44±0.48 4.19 ±0.14 3g CH H OCH3 H (CH2)2N(CH3)2 5.81±0.59 2.24±1.68 2.37±0.30 3h CH H OCH3 H (CH2)2N(C2H5)2 2.8±0.7 2.1±0.1 1.6±0.3 3i N H OCH3 OCH3 (CH2)2N(CH3)2 1.7±0.01 0.71±0.28 0.35±0.03 3l N H OCH3 OCH3 (CH2)2N(C2H5)2 1.71±0,01 0,71±0,28 0.35±0,03 3m N H H H (CH2)2N(CH3)2 1.55±0.05 0.54±0.04 1.08±0.07 3n N H H H (CH2)2N(C2H5)2 2.57±0.21 0.47±0.02 1.63±0.06 3o N H Cl H (CH2)2N(CH3)2 4.20±0.36 1.79±0.05 1.42±0.09 3p N H OCH3 H (CH2)2N(C2H5)2 2.61±1.04 1.90±0.21 1.42±0.09 ELLIPTICINA 0.82±0.15 0.87±0.15 0.77±0.44
43
In particolare il confronto tra i valori ottenuti con le linee cellulari utilizzate ha rivelato che le linee A-431 sono più sensibili delle altre all’effetto esercitato dai composti; inoltre l’effetto maggiore è mostrato dai composti 3i e 3m che presentano, la catena dimetilaminoetilica. Per quanto riguarda gli altri tipi di sostituenti sul sistema tetraciclico, i dati relativi al composto 3o sembrano confermare, come per i derivati precedentemente descritti, l’effetto negativo di un atomo di Cl in posizione 9 del cromoforo. Su questi composti sono stati effettuati anche studi sul dicroismo lineare in flusso (LD) ed i risultati hanno evidenziato che tutti i composti sono in grado di intercalarsi fortemente nel DNA, come è evidente negli spettri LD di soluzioni dei derivati 3i e 3l a due rapporti di concentrazione [DNA]/[composto]. (FIGURA 16a-b)
Figura 16a. Spettri di dicroismo lineare in flusso di una soluzione di DNA da solo e in presenza di 3i con rapporto molare [DNA]/[farmaco]=50 e 25.
44
Figura 16b. Spettri di dicroismo lineare in flusso di una soluzione di DNA da solo e in presenza di 3l con rapporto molare [DNA]/[farmaco]=50 e 25.
Inoltre è stata saggiata la capacità di alcuni composti nel rilassamento dei plasmidi superavvolti di pBR322 DNA mediate da entrambe le topoisomerasi I e II. I risultati attualmente disponibili (figure 17a e 17b, relative al composto 3i) indicano che i piridiotiopiranoindoli, diversamente dai corrispondenti derivati benzotiopiranoindolici della serie 1 non inibiscono l’attività catalitica di entrambi gli enzimi. È stata osservata solo una parziale inibizione della Topoisomerasi I, ma ad una concentrazione 50 µM. DNA Topo II m-A MSA solve nt supercoiled DNA relaxed DNA 10 25 50 Figura 17a
45 DN A Topo I 0.5 5 50 supercoiled DNA relaxed DNA Figura 17b
Ulteriori esperimenti condotti sui derivati piridotiopiranoindolici hanno dimostrato l’incapacità di questi composti ad indurre un incremento dei complessi covalenti topo II-DNA, indicando così che questi derivati non mostrano neppure un comportamento da veleni della topoisomerasi II. Al contrario, i risultati preliminari relativi al derivato 3i indicano un effetto veleno sull’attività della topoisomerasi I come mostrato in figura 18.
DN A Topo I 0.5 5 50 CPT supercoiled DNA relaxed DNA nicked DNA Figura 18
46
I risultati finora ottenuti indicano che gli scaffold benzotiopiranoindolico e piridotiopiranoindolico sono degli ottimi sistemi di partenza per l’ottenimento di inibitori degli enzimi topoisomerasi. In particolare, i derivati benzotiopiranoindolici potrebbero essere potenziali inibitori duali delle topoisomerasi I e II, mentre il sistema isostero piridotiopiranoindolico è un ottimo sistema di partenza per l’ottenimento di efficaci veleni della topoisomerasi I.
Nel mio lavoro di tesi ho proseguito la sintesi di queste serie di composti, al fine di ottenere una ottimizzazione degli elementi strutturali necessari alla definizione di uno specifico profilo di attività biologica. In particolare ho preparato i composti trimetossibenzotiopiranoindolici 2a e 2b sostituiti sull’azoto rispettivamente con le catene dimetilamminoetilica e dietilamminoetilica e dei composti piridotiopiranoindolici (3 a-d) variamente sostituiti in posizione 9 con un atomo di cloro o un gruppo metossilico e recanti lo stesso tipo di catene sull’azoto indolico.
2a: R = CH2CH2N(CH3)2 3a: X= OCH3; R = CH2CH2N(CH3)2 2b: R = CH2CH2N(C2H5)2 3b: X = OCH3; R = CH2CH2N(CH2CH3)2
3c: X= Cl; R = CH2CH2N(CH3)2 3d: X = Cl; R = CH2CH2N(CH2CH3)2
47
La procedura sintetica utilizzata per l’ottenimento dei derivati benzotiopiranoindolici 2a e 2b prevede la preparazione del nuovo sistema tetraciclico 4, sostituito in posizione 2, 3 e 7 con un gruppo metossilico, secondo la procedura riportata nello Schema 1. [48]
48
(i) NaOH 10%,NaHCO3 10%, Δ 60° C (ii) MSA Δ (iii) HCOOEt/ MeONa toluene
anidro (iv) soluz HCl 18%, NaNO2/H2O (v) MeOH/soluz satura AcONa (vi):AcOH Δ
La sintesi viene effettuata utilizzando come prodotto di partenza il 3- metossitiofenolo commerciale che viene fatto reagire con acido 3- bromopropionico, in soluzione di NaOH, ad ottenere l’acido 3-(3- metossifenil)tiopropionico 8.
Il composto 8 in soluzione con MSA a 75° C per 30 minuti ciclizza a dare il chetone 7, con una resa del 45%. Il chetone viene fatto reagire con formiato di etile in presenza di metilato di sodio in rapporto rispettivamente 1:2:2 in toluene anidro, a temperatura ambiente per 18h, per ottenere il prodotto 6 con resa del 52%.
L’ α-idrossimetilenderivato 6 viene ottenuto sufficientemente puro da poter essere utilizzato come tale nelle reazioni successive e rappresenta l’intermedio chiave per la preparazione del derivato desiderato. Si procede con l’ottenimento dell’arilidrazone 5 per mezzo della reazione di Japp-Klingeman [49] e la successiva ciclizzazione indolica di Fisher [50] di quest’ ultimo (schema 1).
Ad una soluzione idrometanolica del derivato 6, in presenza di acetato di sodio, viene aggiunta lentamente, raffreddando in bagno di ghiaccio, la soluzione acquosa del sale di diazonio della 3,4-dimetossianilina. Si può notare l’immediata formazione di un precipitato rosso-arancio, corrispondente all’arilidrazone 5 che risulta essere sufficientemente puro da essere utilizzato come tale nella reazione di ciclizzazione che porta all’ottenimento del prodotto 4.
La reazione di Japp-Klingeman consiste nella copulazione, in adatte condizioni, di un sale di diazonio con un composto contenente un gruppo metinico attivato. Probabilmente, la reazione procede con la formazione dell’intermedio 10 che per
49
scissione idrolitica e con perdita dello ione formiato, seguita dal riarrangiamento del doppio legame N=N, fornisce il prodotto arilidrazonico desiderato.
10
L’intermedio 10 deriva dalla diretta unione tra l’anione del composto contenente il gruppo metinico ed il catione diazonico.
Non è da escludere comunque la formazione come primo intermedio di reazione, del composto 11 :
11
Dall’arilidrazone 5 si perviene, nelle condizioni di Fisher, al prodotto indolico 4. La ciclizzazione è effettuata in acido acetico a riflusso; dopo raffreddamento, a seguito dell’aggiunta di ghiaccio alla soluzione, si ottiene un precipitato che viene filtrato.
50
Il derivato tetraciclico 4 è quindi ulteriormente funzionalizzato con le catene dimetilaminoetilica e dietilaminoetilica che, come già discusso nel precedente studio, avevano fornito i prodotti più attivi.
Lo step finale consiste quindi nell’alchilazione del composto 4 che viene effettuata in DMF anidra, utilizzando NaH come base per catalizzare la reazione con gli opportuni dialchilaminoalchil cloruri cloridrati [50,51] (schema 2).
SCHEMA 2
Per quanto riguarda i composti piridotiopiranoindolici 3a-b, la procedura di sintesi è analoga a quella utilizzata per i compositi benzotiopiranoindolici ed è riportata nel seguente Schema 3 [24]
51
SCHEMA 3
(i) NaOH 10%,NaHCO3 10%,Δ; (ii) Ac2O/AcONa Δ; (iii) HCOOEt/MeONa toluene
anidro (iv) soluz HCl 18%, NaNO2/H2O (v) MeOH/soluz satura AcONa (vi) AcOH
52
L’acido mercaptonicotinico 12, prodotto commerciale, viene fatto reagire con l’acido 3-bromopropionico, in soluzione acquosa di NaOH, ad ottenere l’intermedio acido 3-(3-carbossi-2-piridiltio)propionico 13. Quest’ultimo è poi ciclizzato a tiopiran[2,3-b]piridindione 14 per riscaldamento in eccesso di Ac2O,
alla temperatura di 150°C ed in presenza di AcONa anidro (schema 3).
Il piridotiopiranone 14 è stato formilato ad α-idrossimetilenderivato 15, utilizzando Na metallico disciolto in MeOH con aggiunta di una soluzione di toluene anidro ed etilformiato, e solubilizzando 14 in toluene anidro. Il derivato α-idrossimetilenico 15 viene fatto reagire con la soluzione acquosa del sale di diazonio opportunamente sostituito in posizione para (X) con un gruppo metossilico o un atomo di cloro, ottenendo i derivati idrazonicici 16a-b. Questi intermedi non necessitano di purificazione e vengono sottoposti come tali a ciclizzazione indolica di Fisher, utilizzando acido acetico a reflusso. Dopo raffreddamento, la miscela di reazione è versata in ghiaccio ottenendo i derivati piridotiopiranoindolici 17a-b.
I tetracicli 17a-b sono stati quindi funzionalizzati in posizione 6 con le catene dialchilaminoalchiliche, nelle condizioni precedentemente descritte (schema 4). Per condensazione degli indoli 17a-b con gli appropriati dialchinoammino cloruri cloridrati, in DMF anidra, a 100°C e in presenza di NaH, è stato possibile ottenere i composti 3a-b e 3d desiderati. [52-53]
53
SCHEMA 4
Attualmente si sta procedendo alla messa a punto della sintesi del composto 3c, 9-clorosostituito recante la catena alchilica più corta dimetilamminoetilica che aveva già dato problemi (vedi minori rese) nei corrispondenti derivati benzotiopiranoindolici e nell’analogo derivato 9-metossi sostituito.
I composti 2a-b e 3a-b,d così ottenuti sono stati trasformati nei corrispondenti cloridrati, per renderli più solubili nei solventi utilizzati nei saggi biologici. Saranno quindi inviati al gruppo di ricerca dell’università di Padova dove verrà valutata inizialmente l’attività citotossica e, successivamente, verranno approfonditi i meccanismi cellulari eventualmente coinvolti.
54