MATERIALI E METOD

Parte sperimentale

Se non diversamente indicato, tutti i solventi e i reagenti utilizzati per la sintesi sono stati acquistati direttamente dai fornitori e sono stati utilizzati senza ulteriore purificazione. Come agente essiccante è stato usato solfato di magnesio. L'evaporazione è stata eseguita sotto vuoto (evaporatore rotante). I Rendimenti (%) si riferiscono a composti cromatograficamente puri e spettroscopicamente omogenei (1H-NMR). Le reazioni sono state monitorate attraverso cromatografia su strato sottile ( TLC ), effettuata su un foglio di alluminio silicato ( MARCA 60 F - 254, spessore 0,2 mm ) . Gli spettri di risonanza magnetica del protone (1H-NMR) sono stati registrati in dimetilsolfossido deuterato (DMSO - d6) o in cloroformio deuterato ( CDCl3 ) utilizzando uno

Spettrometro Bruker 400 MHz. I punti di fusione sono stati determinati utilizzando un apparecchio Reichert Köfler .

Acido 3-(3-metossifenil)tiopropionico 8

Ad una soluzione, ottenuta sciogliendo 1.711 g (42.78 mmoli) di NaOH in 17.11 mL di acqua distillata, sotto agitazione magnetica, sono aggiunti 2.2 ml (17.82 mmoli) di 3-metossitiofenolo. Parallelamente, ad una soluzione ottenuta sciogliendo 1.796 g (21.4 mmoli) di NaHCO3 in 18,0 mL di acqua distillata sono

aggiunti poco alla volta, 3.272 g (21.4 mmoli) di acido 3-bromopropionico. Le due soluzioni sono unite e scaldate a 60°C. Dopo 6 ore, la miscela di reazione è controllata mediante TLC (Etere di petrolio 40-60°/AcOEt 5:5); essendo sempre presente il prodotto di partenza, viene lasciata a in agitazione tutta la notte e scaldata. Dopo 24 ore, si aggiungono ulteriori 1.363 g di acido 3-bromo propionico in una soluzione al 10% di bicarbonato e la miscela è scaldata a riflusso per altre 3 ore. La soluzione raffreddata viene estratta con Et2O (3x) e la

fase acquosa viene acidificata con HCl concentrato fino a pH 2. La soluzione ottenuta viene estratta con diclorometano (4x), seccata con MgSO4, filtrata e

concentrata a pressione ridotta, ottenendo 3.099 g (3,41 mmoli) di prodotto desiderato 8.

Resa:83 %, P.f: 55-58 P.f. rif. 56-58°C [54]

7-metossi-2,3-diidro-4H-1-benzotiopiran-4-one 7

3.099 g (14,74 mmoli) di 8 vengono addizionati a 61,22 mL di acido metansolfonico (MSA) e fatti refluire a 75°C per 16 ore monitorando con TLC (Etere di petrolio 40-60°/AcOEt 5:5). Dopo raffreddamento la soluzione è versata in ghiaccio ed estratta con AcOEt (4x). La fase organica è lavata con una soluzione di NaOH al 10%, seccata su MgSO4, filtratata ed evaporata.

Il prodotto grezzo ottenuto viene purificato mediante colonna cromatografica (ø = 5 cm, h = 15 cm, miscela eluente: Etere di petrolio 40-60°/AcOEt 5:5?). Sono stati ottenuti 1.282 g (6.60 mmoli) di prodotto 7.

Resa: 45%; P.f: 53-55°C. P.f. rif. 54-55°C [54]

3-Idrossimetilen-7-metossi-2,3-diidro-1-benzotiopiran-4(4H)-one6

455.5 mg (19.8 mmoli) di Na metallico vengono solubilizzati in 5.15 mL di MeOH assoluto e alla soluzione ottenuta, in corrente di azoto anidro, vengono addizionati 7.30 mL di toluene anidro. La miscela, raffreddata in ghiaccio, viene addizionata, goccia a goccia di una soluzione 2.13 mL (26.4 mmoli) di etilformiato in 2 mL di toluene anidro e, successivamente, di 1.282 g (6.60 mmoli) di prodotto 7 in 8 mL di toluene anidro. La soluzione ottenuta, viene lasciata in agitazione a temperatura ambiente per tutta la notte. Dopo 18 ore (controllando mediante TLC: Toluente/AcCN 9:1), la miscela ottenuta viene estratta con H2O e acidificata

con HCl concentrato. Si forma un precipitato giallo che viene filtrato ottenendo 758 mg (3.41mmoli) di prodotto desiderato 6.

Resa: 52%; P.f: 89-92° C. P.f rif. 90-92°C [55]

3-[2-(3,4-dimetossifenil)idrazono]-7-metossi-2,3-diidro-1-

benzotiopiran-4(4H)-one 5

Una soluzione di prodotto 6 (379 mg, 1,70 mmoli) in 15 ml di metanolo, è stata addizionata ad una soluzione satura di acetato di sodio 418.3 mg (5.1 mmoli). Dopo raffreddamento a 0 °C, viene aggiunta, goccia a goccia, una soluzione di sale di diazonio, ottenuto da 336.53 mg (2.10mmoli) di 3-4 dimetossianilina, in

2.67 mL di HCl al 18 %. e 174.91 mg (2.53 mmoli) di nitrito di sodio in 3.25 mL di H2O. La miscela di reazione viene lasciata in agitazione a 0°C per 30 minuti ed a

temperatura ambiente per 17 ore controllando mediante TLC (Etere di petrolio 40-60°/AcOEt 5:5).

Si forma un precipitato rosso che viene filtrato e purificato mediante colonna cromatografica (ø= 3 cm ;h=15 cm, miscela eluente Etere di petrolio 40- 60°/AcOEt 5:5) ad ottenere 420 mg (1.17 mmoli) di prodotto desiderato 5.

Resa 34%; p.f.: 135-140°C; 1H-NMR (CDCl3, ppm)3.86 (s, 3H, OCH3); 3.87 (s,3H,

OCH3); 3.92 (s, 3H, OCH3); 4.03 (s,2H, CH2-S); 6.73-6.79 (m, 2H, ArH); 6.80-6.84

(m, 2H, ArH); 6.99 (d, 1H J=2.4 Hz, ArH); 8.03 (d, 1H J=8.8 Hz, ArH)

2,3,7-trimetossi-benzo[3’,2’:5,6]tiopirano[3,2-b]indol-10(11H)-one 4

420 mg (1.17 mmoli) di prodotto 5 vengono sospesi in 11.0 mL di AcOH glaciale a riflusso a 110°C per 4 ore controllando l’andamento della reazione mediante TLC (diclorometano/MeOH 9:1). Dopo raffreddamento alla miscela viene addizionato del ghiaccio e si ha la formazione di un precipitato che viene filtrato. Si ottengono 300 mg (0.910 mmoli) di prodotto puro 4.

Resa =78% ; p.f= 313-315°C; 1H-NMR DMSO, ppm) 3.87(s, 6H); 3.94 (s, 3H); 7.02 (s, 1H); 7.21, 7.19 (dd, 1H , Jmin = 2.8 Hz; Jmax = 8.8 Hz); 7.26 (s, 1H); 7.48 (d,

2,3,7-trimetossi-11-(dimetilamminoetil)-benzo[3’,2’:5,6]tiopirano[3,2-

b]indol-10-one 2a

2,3,7-trimetossi-11-(dietilamminoetil)-benzo[3’,2’:5,6]tiopirano[3,2-

b]indol-10-one 2b

Ad una sospensione di 193 mg (0.586) del tetraciclo 4 in 3 mL di DMF anidra, in bagno di ghiaccio, vengono disciolti, in corrente di azoto anidro, 42.19 mg (1.76 mmoli) di NaH e si lascia per in agitazione a temperatura ambiente per un’ora. Quindi vengono addizionati 126.63 mg (0.879 mmoli) dell’opportuno dialchilammino alchilioduro. Dopo 16 h la reazione non è andata a completezza (controllando mediante TLC: diclorometano/MeOH 9:1), così la miscela di reazione viene scaldata a 100°C per 4 ore. Dopo raffreddamento la soluzione è gocciolata in ghiaccio e si ha la formazione di un precipitato bruno che viene filtrato. Entrambi i prodotti grezzi 2a e 2b vengono purificati con colonne cromatografiche (ø=2 cm, h=15 cm, miscela eluente Diclorometano/MeOH 9:1).

2a Resa: 78%; p.f 142°C-145°C; 1H-NMR (CDCl3) 2.61 (s, 6H ); 3.07-3.10 (m, 2H); 3.95 (s,3H); 3.99 (s,3H); 4.09 (s,3 H); 5,14 (t,2H J=8 Hz) ; 7.09-7,14 (m,3 H); 8,01 (s, 1H); 8.62 (d, 1H J= 9.2 Hz) 2b Resa: 67%; p.f 150°-153°; 1H-NMR (CDCl3, ppm)2.86-2.87 (m, 4H); 2.98-3.07 (m,2H); 3,48 (s,6H); 3.93 (s,3H); 3.98 (s,3H); 4,05 (s,3H); 4.90-5.07 (m,2H); 7.06- 7.11 (m, 3H); 8.62 (d, 1H J=7.6 Hz)

Acido 3-(3-carbossi-2-piridiltio) propionico 13

A 2.00 g (12.98 mmoli) di acido 2-mercaptonicotinico, solubilizzati in 60 ml di NaOH al 10%, viene addizionata, goccia a goccia e sotto costante agitazione magnetica, una soluzione ottenuta sciogliendo 2.10 g (14.45 mmoli) di acido 3- bromopropionico in una soluzione di NaHCO3 al 10%.

La miscela di reazione viene scaldata a 60 °C e mantenuta in agitazione per 6 ore, fino alla scomparsa del prodotto di partenza (monitorando mediante TLC diclorometano/MeOH 9:1). Dopo raffreddamento si ottiene una soluzione che viene raffreddata in bagno di ghiaccio e trattata con HCl conc. fino a pH=2. Per filtrazione si recuperano 3.90 g (17.16 mmoli) di solido bianco corrispondente al prodotto desiderato 13.

Resa: quantitativa ; Pf:202-203°C; P.f. rif. 201-203°C [24]

2H-tiopiran-[2,3-b]-piridin-4(3H)-one 14

4,3 g (18.92 mmoli) di prodotto 13 vengono sospesi in 32.15 mL di Ac2O e

addizionati di 2.80 g (34.06 mmoli) di AcONa. La miscela di reazione viene scaldata a riflusso per 16 ore, monitorando mediante TLC (Etere di petrolio 40- 60°/AcOEt 7:3). Dopo raffreddamento, si aggiungono 2 mL di H2O e si alcalinizza

con NH4OH fino a pH 8/9. Si ottiene una sospensione che viene filtrata, per

eliminare il solido indisciolto, e quindi estratta con AcOEt a porzioni successive. La fase organica, seccata su MgSO4 ed evaporata a secco, fornisce un olio giallo

arancio che viene purificato mediante cromatografia flash (ø=5 cm; h=20 cm, miscela eluente Etere di petrolio 40-60°/AcOEt 5:5). Si ottengono 1,023 g (6.19 mmoli) di prodotto desiderato 14 .

3-(idrossimetilen)-2H-tiopiran[2,3-b]piridin-4(3H)-one 15

241.5 mg (10.5 mmoli) di Na metalllico vengono solubillizati in 2.7 mL di MeOH assoluto e alla soluzione ottenuta, in corrente di azoto anidro, vengono addizionati 3.9 mL di toluene anidro. La miscela, raffreddata in ghiaccio, viene addizionata, goccia a goccia di 0,85 ml (10.5 mmoli) di etilformiato in 3.9 mL di toluene anidro e, successivamente, di 867 mg (5,25 mmoli) di prodotto 14 in 6 mL di toluene anidro. La miscela di reazione viene lasciata in agitazione a temperatura ambiente per 50 ore controllando mediante TLC (miscela eluente toluene/AcCN 9:1). La miscela ottenuta viene estratta con H2O (3 mL) e

acidificata con HCl conc. fino a pH=3-4. Si forma un precipitato che viene filtrato. Vengono estratte anche le acque madri con diclorometano (4x), e la fase organica è seccata su MgSO4, filtrata e evaporata. Si ottengo in tutto 784 mg

(4.06 mmoli) di prodotto desiderato 15.

Resa: 77%; P.f: 188-190°C; P.f. rif. 188-190°C [24].

3-[2-(4-metossifenil)idrazono]-2H-tiopiran[2,3-b]piridin-4(3H)-one

16a

3-[2-(4-clorofenil)idrazono]-2H-tiopiran[2,3-b]piridin-4(3H)-one 16b

Una soluzione di prodotto 15 (392 mg, 2.03 mmoli) in 15 mL di MeOH, è stata addizionata di una soluzione acquosa satura di AcONa (499 mg, 6.09 mmoli). Dopo raffreddamento a 0 °C, viene aggiunta, goccia a goccia, una soluzione di sale di diazonio ottenuta da 325 mg (2.46 mmoli) dell’opportuna anilina in 3.36 mL di HCl al 18% e una soluzione di 210 mg (3.04 mmoli) di NaNO2 in 3.90 mL di

a temperatura ambiente per 23 ore monitorando mediante TLC (Etere di petrolio 40-60°/AcOEt 5:5).

Si ottiene una sospensione che viene filtrata, ed il solido raccolto, viene lavato con acqua ottenendo i prodotti desiderati 16a e 16b che vengono utilizzati senza ulteriore purificazione nella reazione successiva.

16a Resa:38%;P.f. :133-135°C; P.f. rif. 132-136°C [24]. 16b Resa 50%;P.f=128-131°C; P.f. rif. 126-130°C [24]

9-metossipirido[3',2':5,6]tiopiran[3,2-b]indol-5(6H)-one 17a

9-cloropirido[3',2':5,6]tiopiran[3,2-b]indol-5(6H)-one 17b

Una sospensione dell’opportuno fenilidrazone 16a e 16b (0.76 mmoli) in 7.17 mL di AcOH glaciale viene scaldata a 110°C per 10 ore controllando l’andamento della reazione mediante TLC (AcOEt/Etere di petrolio 5:5). Dopo raffreddamento, la soluzione ottenuta viene versata in ghiaccio e la sospensione ottenuta viene filtrata. Si ottengono così i prodotti 17a e 17b.

17a Resa:53 %; P.f= 246-248 °C; P.f. rif. 247-250°C[24]. 17b Resa:65%; P.f>300°C;P.f. rif. >300°C [24].

6-((dimetilamino)etil)-9-metossipirido[3',2':5,6]tiopiran[3,2-b]indol-

5(6H)-one 3a

6-((etilamino)etil)-9-metossipirido[3',2':5,6]tiopiran[3,2-b]indol-5(6H)-

one 3b

9-cloro-6-((dietilamino)etil)pirido[3',2':5,6]tiopiran[3,2-b]indol-5(6H)-

one 3d

Ad una soluzione (0.40mmoli) dell’opportuno tetraciclo 17a o 17b in 2 mL di DMF anidra, vengono addizionate, 96 mg (4 mmol) di NaH, sotto agitazione, in atmosfera di azoto. Dopo 1 ora si aggiungono 86.42 mg (0.6 mmoli) dell’ opportuno dialchilamino alchilioduro cloridrato e si lascia in agitazione a temperatura ambiente per 13 ore monitorando la reazione mediante TLC (diclorometano/MeOH 9:1). Quindi si scalda a 100 °C per 4 ore. Dopo raffreddamento la soluzione di 17a ottenuta viene versata in ghiaccio ed estratta con diclorometano (x 4 volte), e la fase organica è seccata su MgSO4, filtrata e evaporata. Il prodotto grezzo viene purificato mediante colonna cromatografica (ø=2 cm, h=15 cm, miscela eluente diclorometano/MeOH 9:1).

La soluzione di 17b invece, viene gocciolata in ghiaccio, si forma così un precipitato che viene filtrato. Il filtrato viene purificato mediante colonna cromatografica (ø=2 cm, h=14 cm, miscela eluente diclorometano/MeOH 9:1)

3a Resa: 16%; p.f: 103-106°C ;1H-NMR (DMSO, ppm)  2.21 (s, 6H, N(CH3)2);

2.62(t, 2H J = 6.8Hz); 3.89 (s, 3H, OCH3); 4.94( t, 2H J = 6.8 Hz); 7.25, 7.28 (dd, 1H

Jmin = 2.8 Hz, Jmax = 8.8 Hz); 7.40 (d, 1H J = 2.4 Hz, ArH);7.68-7.71 (m, 1H, ArH);

64 3b Resa: 52%; p.f: 97-100°C ;1H-NMR (DMSO, ppm)  1.18 (t, 6H, N(CH2CH3)2); 2.50-2.76 (m, 6H, N(CH2CH3)2, NCH2CH2); 3.86 (s, 3H, 3-OCH3); 4.86 (t, 2H, NCH2CH2); 7.25-7.67 m, 4H, 4-H, 9-H, 8-H); 8.85-8.88 (m, 2H, 1-H 7-H) 3d Resa: 70%; p.f= 113-115 °C 1H-NMR (DMSO,ppm) 0.74 (t, 6H, J=7,2 Hz, N(CH2CH3)2); 2.44 (q, 4H, J = 7.2 Hz, N(CH2CH3)2); 2.72 (t ,2H J = 6.4 Hz, NCH2CH2); 4.92 (t, 2H J = 6.4 Hz, NCH2CH2); 7.61,7.63 (dd, 1H, J=2 Hz, J = 9.2 Hz); 7.70-7.73

(m, 1H, Ar-H); 7.86 (d,1HJ=9.2 Hz, Ar-H); 8.15 (d,1H, J= 2 Hz, Ar-H), 8.88-8.90 (dd, 1H Jmin = 2 Hz Jmax = 8 Hz, Ar-H) 8.92, 8.94 (dd, 1H, Jmin = 2 Hz Jmax = 6.4 Hz, Ar-H)

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Ringraziamenti

Non è facile racchiudere questi 5 anni in poche righe e ringraziare tutte le persone che ne hanno fatto parte.

Ringrazio intanto le Professoresse che hanno reso possibile questa bellissima esperienza di ricerca presso l’università di Pisa, la Professoressa Anna Maria Marini e la Dott.ssa Silvia Salerno.

Non da meno sono i ringraziamenti a due ragazzi speciali, Elisabetta Barresi, l’assegnista o meglio detta “senior researcher “, che oltre a insegnarmi questa nuova realtà si sono dimostrati delle splendide persone e con le quali ho passato dei momenti molto divertenti.

Ringrazio anche il personale della farmacia presso la quale ho svolto la mia esperienza di tirocinio, in particolare al mio tutor Piero Paoletti, che molto paziente mi ha seguito nella mia esperienza, insegnandomi tutto ciò che fosse necessario e rendendomi partecipe a tutte le attività.

Importanti sono state anche le mie “colleghe” e compagne di innumerevoli esami, esami dell’ultimo minuto e esami sudati per dei mesi, a Rebecca a Elisa e a Maria, il quartetto di Viareggio. Sempre al mio fianco ci sono state anche Eva, Rachele ,Marianna e Virginia, chi più chi meno ha lasciato un segno in questa esperienza.

Alle mie compagne di laboratorio, “le tesiste” Alessandra, Elisa e Chiara, con le quali ho condiviso momenti esilaranti e di disperazione più profonda, pranzi ghiacciati e caffè imbevibili. Un grazie anche a Matilde che ha permesso che mi laureassi facendomi rispettare tutte le scadenze, innumerevoli e incomprensibili scadenze.

Alle mie amiche, un grazie sincero, un grazie per questi anni passati insieme, un grazie agli anni che verranno, che ci vedranno sempre più impegnate ma sempre più legate da questo grande sentimento, a Eleonora, a Elisa, a Giulia, a Ilaria, a Irene e a Vanessa , che tutti i vostri desideri si avverino.

A Michael, che ha preso parte alla maggior parte di questi fatidici anni, anni di crescita e di nuove esperienze. Lo ringrazio per la pazienza, talvolta troppa e talvolta troppo poca, ma che mi ha consolato nei momenti più difficili e che ha gioito con me in quelli più belli.

Alla mia famiglia, la mia ancora, la mia spinta nell’oceano del futuro, le mie radici, il mio tutto. A mia mamma, fragile ma una roccia , mamma ma amica, sempre vicina a me, la mia spalla.

A mio padre, severo ma dolce, distante ma sempre presente, che mi ha insegnato a crescere e ad adempire ai mei doveri.

A mio fratello, con il quale sto crescendo, e che mi riempie di gioia. È difficile a quest’età andare d’accordo, ma per noi è sempre stato semplice, è grande la complicità che ci unisce (eccetto per fare le pulizie).

A mia zia Donatella, che mi ha supportato e mi è sempre stata vicina, con quell’affetto un pò da mamma che la rende così speciale.

A mia nonna, il cui sorriso mi riempie il cuore, una donna che vive per la sua famiglia e ama con tutta se stessa.

In fine un grazie speciale a mio nonno, la mia camelia, un uomo con grande grinta fino in fondo, che ha amato tanto, ha fatto del gran bene . Mi piace pensare di poter essere anche solo una piccola parte della grande persona che eri.

Grazie a tutti voi, voi che ci siete e mi auguro rimarrete nella mia vita, mi avete dato tanto ed è un in parte grazie a voi che oggi sono quella che sono.

Nel documento Sviluppo di derivati benzotiopiranoindolici e piridotiopiranoindolici, quali potenziali inibitori delle topoisomerasi I e II (pagine 55-72)