In questo lavoro di tesi, la suberina proveniente dalle cortecce di otto diverse specie arboree (Betula pendula, Quercus suber, Quercus robur, Quercus ilex, Castanea sativa, Carpinus
betulus, Fagus sylvatica e Populus nigra) è stata studiata sviluppando e combinando
diverse tecniche chimico-analitiche: la gascromatografia accoppiata a spettrometria di massa (GC/MS), alcune tecniche basate su spettrometria di massa diretta (la spettrometria di massa ad esposizione diretta, DE-MS, la spettrometria di massa dei gas evoluti, EGA- MS, e la ionizzazione elettrospray con spettrometria di massa mediante analisi con iniezione in flusso, FIA-ESI-MS), la pirolisi analitica con derivatizzazione in situ (py- GC/MS) e la spettroscopia infrarossa a trasformata di Fuorier (FT-IR). Gli aspetti più innovativi di questo lavoro hanno riguardato appunto l’utilizzo integrato di diverse tecniche analitiche per lo studio della suberina, che ha abbracciato anche specie scarsamente considerate in letteratura. Inoltre, a causa della complessità dei risultati ottenuti in relazione proprio alla natura chimica di questo biopolimero, in alcuni casi i dati sono stati trattati tramite tecniche di analisi statistica multivariata (analisi delle componenti pricipali, PCA) in modo da poter agevolmente comparare i risultati ottenuti da un numero elevato di campioni ed evidenziare similitudini e differenze composizionali in quest’ultimi.
Nel dettaglio, lo studio GC/MS ha permesso di calcolare le composizioni medie delle specie studiate (Betula pendula, Quercus suber, Quercus robur, Quercus ilex, Castanea sativa,
Carpinus betulus, Fagus sylvatica e Populus nigra) e di ottenere dei profili caratteristici.
La Betula pendula ed il Quercus suber risultano diversi dalle altre specie, poiché i monomeri a catena lunga (da C20 fino a C24) tendono a prevalere su quelli a catena media (da C16 a C18). In particolare, è possibile inserire queste specie in un gruppo e suddividere le altre in due sottogruppi, ponendo nel primo le specie dove i monomeri a catena media (da C16 a C18) prevalgono su quelli a catena lunga (da C20 fino a C24) (Quercus ilex e
Populus nigra) e nel secondo le specie dove le lunghezze dei monomeri sono confrontabili
tra di loro (Quercus robur, Castanea sativa, Carpinus betulus e Fagus sylvatica). L’analisi delle componenti principali (PCA) a partire dalla matrice delle covarianze delle abbondanze medie relative dei monomeri, oltre ad avvalorare questa descrizione, ha anche consentito di suddividere il sottogruppo più grande in altre due coppie, formate rispettivamente dal Carpinus betulus e dal Fagus sylvatica, da una parte, e dal Quercus
robur e dalla Castanea sativa, dall’altra.
Le rese di depolimerizzazione e di estrazione calcolate hanno inoltre indicato un contenuto di suberina e di estrattivi maggiore nelle cortecce della Betula pendula e del Quercus suber rispetto alle altre specie considerate. Nel primo caso queste componenti rappresentano infatti una frazione uguale al 63 % della massa secca, mentre nel secondo caso una frazione pari al 45 %. Le altre specie mostrano invece percentuali di suberina e di estrattivi piuttosto basse, che oscillano tra il 4 e l’11 %, risultando quindi simili tra di loro. La suddivisione in due gruppi proposta appare pertanto appropriata sia in relazione alla composizione monomerica che all’abbondanza di queste componenti.
Lo studio EGA-MS ha prodotto dei profili diversi per la Betula pendula e per il Quercus
suber rispetto alle altre specie studiate. I primi presentano infatti un picco preceduto da una
spalla, mentre per gli altri accade esattamente il contrario, ovvero i profili mostrano un picco succeduto da una spalla. In particolare, per la Betula pendula e per il Quercus suber il massimo sopraggiunge a circa 40 minuti (450 °C), mentre per le altre specie a circa 30 minuti (350 °C). Le differenze potrebbero dunque essere spiegate dalla diversa composizione della corteccia, che presenta per i primi un contenuto maggiore di suberina, mentre per gli altri un contenuto maggiore di olocellulosa e di lignina. Il picco a circa 30 minuti potrebbe quindi corrispondere all’evoluzione dei gas da componenti diversi dalla suberina quali i polisaccaridi, mentre quello a circa 40 minuti all’evoluzione dei gas da
questo biopolimero, che risulta particolarmente resistente al calore (lo studio py-GC/MS è stato appunto condotto a 450 °C dopo l’ottimizzazione dei parametri).
Lo studio DE-MS ha portato sostanzialmente alle stesse conclusioni, rimarcando le differenze osservate per la Betula pendula e per il Quercus suber rispetto alle altre specie esaminate attraverso l’analisi delle componenti principali (PCA) a partire dalla matrice delle covarianze delle abbondanze relative dei picchi nell’intervallo di tempo compreso tra 0,3 e 1 minuti per entrambi i tipi di ionizzazione (elettronica e chimica).
Lo studio FIA-ESI-MS ha condotto analogamente alle stesse conclusioni, ripresentando le differenze osservate per la Betula pendula e per il Quercus suber rispetto alle altre specie
analizzate. I profili FIA-ESI-MS degli idrolizzati parziali ottenuti con Ca(OH)2 sospeso in
MeOH sia mediante agitazione che mediante sonicazione della Betula pendula e della
Castanea sativa sono stati inoltre confrontati con quelli degli estratti in Et2O ottenuti dagli
idrolizzati totali (Mep in MW) delle stesse specie. In entrambi i casi l’idrolisi parziale porta alla formazione di oligomeri ad alto peso molecolare, che non sono presenti nei profili degli
estratti in Et2O. In particolare queste specie potrebbero non formarsi con l’idrolisi totale
dei campioni oppure potrebbero non essere estratte dai solventi impiegati (nEs ed Et
2O). Le
differenze presenti nei profili sottolineano dunque la sensibilità del processo alle condizioni sperimentali, come era già stato evidenziato dallo studio GC/MS.
La pirolisi analitica (py-GC/MS) ha confermato il divario esistente tra la Betula pendula ed il Quercus suber, da una parte, e le altre specie considerate, dall’altra, riguardo al contenuto di suberina e di estrattivi. L’estrazione del frammento a m/z 117 (dovuto al catione trimetilsililossi(osso)metilio che deriva dalla frammentazione della funzionalità carbossilica degli acidi derivatizzati) dai pirogrammi TIC dei primi produce infatti un profilo caratteristico formato dai doppietti degli acidi carbossilici e dei loro analoghi insaturi, che praticamente non è osservabile per gli altri. All’aumentare della massa molecolare prevale comunque l’acido carbossilico saturo ed i doppietti tendono a scomparire sia nella Betula pendula che nel Quercus suber. Le altre specie mostrano invece dei pirogrammi piuttosto simili tra di loro, poiché prevalgono gli altri componenti della corteccia, ovvero l’olocellulosa e la lignina. Le differenze presenti nei profili devono quindi essere ricercate nella diversa distribuzione di questi domini, poiché i prodotti di pirolisi principali sono gli stessi, anche se le proporzioni sono variabili.
Lo studio FT-IR prima dell’idrolisi ha presentato dei profili diversi per la Betula pendula e per il Quercus suber rispetto a quelli delle altre specie valutate, poiché in questi casi i picchi
relativi alla suberina (2919 cm-1, 2854 cm-1 e 1749 cm-1) tendono a prevalere su quelli degli
altri componenti (lignina ed olocellulosa). I profili FT-IR prima dell’idrolisi delle altre specie risultano invece abbastanza simili tra di loro, oltre a presentare un contenuto di suberina e di estrattivi piuttosto scarso. L’idrolisi e l’estrazione influiscono comunque notevolmente sui picchi corrispondenti alla suberina, anche se il processo risulta incompleto per tutte le specie, poiché i picchi decrescono, ma non scompaiono. La permanenza di una parte dei legami esterei giustifica infatti la persistenza di una struttura macromolecolare appartenente a questo biopolimero. Gli altri componenti (lignina ed olocellulosa), al pari della suberina, tendono a diminuire, benché gli effetti appaiano più contenuti e le variazioni dei profili FT-IR causate da quest’ultimi siano piccole se confrontate con quelle dovute all’idrolisi dei legami esterei nella Betula pendula e nel
Quercus suber. L’analisi delle componenti principali (PCA) a partire dalla matrice delle
covarianze delle trasmittanze relative nell’intervallo di lunghezze d’onda compreso tra
1600 e 1800 cm-1 e tra 2800 e 3000 cm-1 ha dunque mostrato che la Betula pendula ed il
Quercus suber sono diversi dalle altre specie, ma anche tra di loro nel secondo intervallo.
Le altre specie sono invece simili tra di loro, anche se il Quercus robur appare differente dagli altri nel primo intervallo di lunghezze d’onda. L’idrolisi e l’estrazione provocano
comunque dei cambiamenti vistosi per la Betula pendula, per il Quercus suber e, tra 1600
e 1800 cm-1, per il Quercus robur, portando queste specie nel raggruppamento che contiene
sia le cortecce che i residui delle altre. Le specie rimanenti non subiscono infatti mutamenti apprezzabili, confermando la scarsa disponibilità di suberina e di estrattivi di quest’ultime. Gli studi effettuati delineano quindi un quadro alquanto chiaro, dove la Betula pendula ed il Quercus suber differiscono dalle altre specie sia per il differente contenuto di suberina e di estrattivi che per la peculiare distribuzione monomerica di queste componenti. Il confronto delle rese di depolimerizzazione e di estrazione, che include anche gli estrattivi nel calcolo (che in questo caso non sono stati eliminati con lavaggi opportuni), suggerisce dunque di utilizzare queste specie per l’ottenimento dei monomeri mostrati in quantità significative. Lo studio FT-IR, effettuato prima e dopo l’idrolisi e l’estrazione, palesa però la scarsa efficacia del processo, poiché in ogni specie una parte della struttura macromolecolare del biopolimero rimane integra. L’ottenimento di aggregati macromolecolari con il peso molecolare desiderato potrebbe comunque costituire una prospettiva interessante e lo studio FIA-ESI-MS conferma la possibilità di ottenere prodotti diversi variando le condizioni sperimentali. La ricerca di condizioni di idrolisi adeguate per gli scopi previsti appare quindi fondamentale per la produzione di composti ad alto valore aggiunto dalla suberina.
Le prospettive future includono dunque l’ottimizzazione delle condizioni di idrolisi sia per l’estrazione totale dei monomeri che per l’ottenimento di macromolecole con caratteristiche definite. La complessità della suberina, oltre a rappresentare una sfida per lo sfruttamento di questo biopolimero, può infatti essere la chiave per la produzione di materiali con proprietà diverse a partire da un diverso trattamento di queste materie prime, che vengono tuttora considerate come un semplice prodotto di scarto della lavorazione del legno.
Appendice A. Specie studiate
In questa appendice vengono descritte da un punto di vista botanico le specie oggetto di questa ricerca di tesi (Betula pendula, Quercus suber, Quercus robur, Quercus ilex,
Castanea sativa, Carpinus betulus, Fagus sylvatica e Populus nigra) [Figure A.1-A.8].
Figure A.1-A.8. Betula pendula, Quercus suber, Quercus robur, Quercus ilex, Castanea sativa, Carpinus