UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI PISA
Dipartimento di Chimica e Chimica Industriale
Corso di Laurea Magistrale in:
CHIMICA
Curriculum: Analitico
Classe: LM 54 (Scienze Chimiche)
Elaborato del Tirocinio:
Tecniche cromatografiche, spettroscopiche
e di spettrometria di massa per lo studio
della suberina di diverse specie arboree
Relatore: Dott.ssa Erika Ribechini
Controrelatore: Prof.ssa Anna Maria Raspolli Galletti
Candidato: Filippo Mangani
Ringraziamenti
Questa tesi costituisce la conclusione di un ciclo iniziato cinque anni fa e, oltre a racchiudere una parte delle conoscenze acquisite durante questo percorso, rappresenta il raggiungimento di quegli obiettivi che sembravano lontani da conquistare e che ora non sono che la base di partenza per affrontare nuove sfide con rinnovato entusiasmo. Le persone che hanno contribuito ad arricchire questa esperienza, anche da un punto di vista non accademico, sono davvero tante e sarebbe impossibile ringraziarle tutte.
Ovviamente non posso non menzionare la mia famiglia, che mi ha supportato e mi ha permesso di tagliare questo piccolo ma importante traguardo della vita.
Un ringraziamento speciale va alla mia relatrice, la Dott.essa Erika Ribechini, per il prezioso contributo in questo lavoro e a tutto il gruppo di ricerca del Laboratorio di Chimica Analitica per i validi consigli e per la disponibilità dimostrata.
Indice
Introduzione e scopo della tesi ... 7
Bibliografia ... 9
1. La suberina: ruolo biologico, composizione chimica ed applicazioni ... 11
1.1. La suberina nei tessuti vegetali ... 11
1.1.1. La suberina nelle pareti delle cellule suberizzate ... 12
1.2. Composizione chimica della suberina ... 13
1.2.1. Composizione monomerica del dominio polialifatico (SPAD) ... 13
1.2.2. Composizione dimerica del dominio polialifatico (SPAD) ... 17
1.2.3. Composizione oligomerica del dominio polialifatico (SPAD) ... 18
1.2.4. Composizione monomerica del dominio polifenolico (SPPD) ... 20
1.2.5. Composizione degli estrattivi ... 21
1.3. Struttura tridimensionale della suberina ... 21
1.4. Biosintesi della suberina ... 22
1.5. Usi ed applicazioni della suberina ... 24
1.B. Bibliografia ... 26
2. Materiali, strumenti e metodi ... 29
2.1. Raccolta e trattamento dei campioni... 29
2.2. Reagenti ... 29
2.3. Strumenti ... 30
2.4. Preparazione dei campioni ... 32
3. Studio della suberina tramite GC/MS... 37
3.1. Sviluppo del metodo ... 37
3.2. Caratterizzazione tramite GC/MS ... 38
3.3. Conclusioni ... 46
3.B. Bibliografia ... 47
4. Studio della suberina tramite tecniche basate su MS ... 49
4.1. Caratterizzazione tramite EGA-MS ... 49
4.2. Caratterizzazione tramite DE-MS ... 53
4.2.1. Caratterizazione tramite DE-EI-MS ... 53
4.2.2. Caratterizzazione tramite DE-CI-MS ... 57
4.3. Caratterizzazione tramite FIA-ESI-MS ... 60
4.4. Conclusioni ... 64
4.B. Bibliografia ... 66
5. Studio della suberina tramite py-GC/MS ... 67
5.1. Caratterizzazione tramite pirolizzatore a filamento ... 67
5.1.1. Sviluppo del metodo ... 67
5.1.2. Risultati ... 70
5.2. Caratterizzazione tramite pirolizzatore a microfornace ... 77
5.2.1. Risultati ... 77
5.3. Conclusioni ... 83
5.B. Bibliografia ... 85
6. Studio della suberina tramite FT-IR ... 87
6.1. Caratterizzazione tramite FT-IR ... 87
6.4. Conclusioni ... 92
6.B. Bibliografia ... 93
7. Conclusioni e prospettive future ... 95
Appendice A. Specie studiate ... 99
A.1. Betula pendula (betulla bianca) ... 100
A.3. Quercus robur (farnia) ... 102
A.4. Quercus ilex (leccio) ... 102
A.5. Castanea sativa (castagno europeo) ... 103
A.6. Carpinus betulus (carpino bianco) ... 103
A.7. Fagus sylvatica (faggio)... 103
A.8. Populus nigra (pioppo nero) ... 104
Introduzione e scopo della tesi
Questo lavoro di tesi è stato incentrato sullo studio e sulla caratterizzazione chimica della suberina al fine di ottenere informazioni su questo materiale, che può essere sfruttato sia come biomassa che come precursore per la produzione di composti ad alto valore aggiunto. La suberina è un biopolimero largamente presente nel mondo vegetale ed in particolare nella parete secondaria delle cellule suberizzate, che possono essere ritrovate in diversi tessuti vegetali specializzati, tra i quali il periderma (porzione della corteccia) delle piante arboree. Le cellule suberizzate svolgono un ruolo fondamentale per la ritenzione dell’acqua, per la termoregolazione, per il trasporto dei soluti e dei gas e per la protezione
dagli organismi patogeni, sia di origine batterica che fungina [1,2].
La struttura macromolecolare della suberina è caratterizzata da un dominio polialifatico (poliestere costituito da diversi monomeri tra i quali glicerolo, acidi alcandioci ed acidi ω-idrossialcanoici) e da un dominio polifenolico (principalmente poli(acido ferulico)), anche se esistono ancora numerosi dubbi su diversi aspetti di questo biopolimero. La letteratura riporta infatti pochi lavori su questo argomento e presenta peraltro alcune contraddizioni sulla reale organizzazione dei polimeri, oltre a prendere in considerazione soltanto un
numero limitato di specie (sostanzialmente Betula pendula e Quercus suber) [3,4,5].
L’approfondimento della conoscenza della chimica di questo biopolimero costituisce quindi la chiave per sfruttare al meglio queste risorse, che trovano tuttora scarse applicazioni in ambito industriale. L’interesse per le risorse rinnovabili sta infatti crescendo sia per motivi economici legati al progressivo aumento del costo dei combustibili fossili che per motivi ambientali connessi all’inquinamento e alla produzione di scarti associati all’impiego di quest’ultimi. In particolare, le risorse rinnovabili vengono definite come specie animali oppure vegetali, che possono essere sfruttate sostenibilmente, senza che possano esaurirsi, poiché possiedono la capacità di rinnovarsi in un intervallo di tempo ragionevole (ovvero in tempi biologici anziché geologici).
Per quanto riguarda le risorse vegetali devono essere principalmente considerate le biomasse che derivano dalle cortecce, dal legno, dai frutti, dai semi, dal fogliame e dalle radici delle piante arboree. Le biomasse sono infatti costituite essenzialmente da carboidrati, da lignina, da proteine, da oli e da estrattivi, che possono essere sfruttati per scopi diversi.
L’uso di reagenti chimici ecosostenibili ed ecocompatibili derivanti da biomasse per la sintesi di polimeri, tra i quali spiccano i poliesteri, rappresenta pertanto il cardine delle moderne bioraffinerie. Tra le bioraffinerie, che svolgono il compito di convertire tali biomasse rinnovabili in energia ed in prodotti ad alto valore aggiunto, consentendo quindi di recuperare e di valorizzare materie di scarto, rivestono un ruolo primario quelle che trattano biomasse agricole, forestali oppure residui organici, sia per la diponibilità di queste risorse a prezzi competitivi che per la capacità di non sottrarre beni all’industria alimentare. Gli obiettivi futuri includono comunque l’implementazione di queste fabbriche ed il concomitante recupero dei sottoprodotti agricoli e forestali che ancora non trovano spazio in questo settore. Per fare un esempio specifico e tangibile può essere citata l’industria del sughero (legata principalmente alla fabbricazione di tappi di bottiglia e di materiali per l’isolamento termico e/o acustico), presente su tutta l’area mediterranea, benché il Portogallo assorba da solo il 50 % della produzione mondiale, che produce scarti (40000
t/y in Portogallo) [1] costituiti fondamentalmente da polvere di sughero, che non possono
essere recuperati per altri scopi, poiché le particelle possiedono una dimensione inadeguata per gli usi attuali. Le polveri generate vengono quindi bruciate per produrre energia, limitando il valore di queste risorse.
In quest’ottica, la chimica analitica svolge un ruolo fondamentale nello studio della suberina, poiché permette di approfondire le caratteristiche chimiche di questo componente
della corteccia, che appare promettente per numerose applicazioni. Infatti, un aspetto fondamentale da conoscere nella scelta di un materiale da sottoporre a trasformazioni e reazioni è la sua composizione chimica. In particolare, per quanto riguarda la suberina, è necessario evidenziare che raramente sono stati compiuti studi approfonditi sulla sua natura chimica. In realtà questo rappresenta un punto focale per lo sfruttamento di questo biopolimero, perché le potenzialità applicative di quest’ultimo sono imprescindibilmente vincolate alla composizione chimica originaria.
In questo ambito è inserito questo lavoro di tesi, che ha affrontato la caratterizzazione chimica della suberina proveniente dalla corteccia di otto diversi alberi, ovvero Betula
pendula, Quercus suber, Quercus ilex, Castanea sativa, Carpinus betulus, Fagus sylvatica
e Populus nigra [Appendice A], tramite un approccio multianalitico basato su tecniche spettroscopiche, cromatografiche e di spettrometria di massa.
Lo studio di tali cortecce, o meglio della frazione di suberina, è stato condotto sia a livello qualitativo, tramite analisi dei gas evoluti abbinata a spettrometria di massa (EGA-MS), spettrometria di massa ad esposizione diretta (DE-MS), analisi con iniezione in flusso e ionizzazione elettrospray accoppiata a spettrometria di massa (FIA-ESI-MS), pirolisi interfacciata a gascromatografia con rivelazione a spettrometria di massa (py-GC/MS) e spettroscopia infrarossa a trasformata di Fourier (FT-IR), che semiquantitativo, tramite gascromatografia accoppiata a spettrometria di massa (GC/MS) al fine di ottenere informazioni complementari su questo biopolimero.
I risultati conseguiti potranno infine essere utilizzati per cercare di ottimizzare lo sfruttamento della suberina, che presenta caratteristiche interessanti non soltanto come biomassa da destinare alla produzione di energia mediante combustione, ma anche come precursore di materiali più pregiati.
Bibliografia
1. Suberin: A Biopolyester of Plants’ Skin, J. Graça, S. Santos, Macromol. Biosci., 7 (2007) 128
2. Demystifying suberin, M. A. Bernards, Can. J. Bot., 80 (2002) 227
3. Composition of Suberin Extracted upon Gradual Alkaline Methanolysis of Quercus
suber L. Cork, M. H. Lopes, A. M. Gil, A. J. D. Silvestre, C. Pascoal Neto, J. Agric. Food Chem., 48 (2000) 383
4. Fragmentation of Suberin and Composition of Aliphatic Monomers Released by
Methanolysis of Cork from Quercus suber L., Analysed by GC-MS, SEC and MALDI-MS,
M. F. Bento, H. Pereira, M. Á. Cunha, A. M. C. Moutinho, K. J. van den Berg, J. J. Boon, O. van den Brink, R. M. A. Heeren, Holzforschung, 55 (2001) 487
5. Some variations in the composition of suberin from the cork layers of higher plants, P.
1. La suberina: ruolo biologico, composizione chimica ed
applicazioni
In questo capitolo vengono descritte le caratteristiche biologiche e chimiche della suberina e vengono riportate alcune applicazioni di questo biopolimero.
1.1. La suberina nei tessuti vegetali
La suberina è un biopolimero presente in alcuni tessuti vegetali specializzati ed in particolare nelle pareti delle cellule suberizzate, delle quali può anche essere il componete principale (nel Quercus suber arriva fino al 50 % della massa secca). Le cellule suberizzate possono essere ritrovate primariamente nel periderma delle piante (sia negli organi aerei, come il fusto, che in quelli sotterranei, come le radici) e secondariamente in altri tessuti vegetali, tra i quali l’endoderma (dove la “banda di Caspary” controlla l’accesso delle sostanze al sistema di conduzione della pianta) e l’ipoderma delle radici ed i tessuti
cicatriziali [1].
La corteccia è un tessuto parenchimatico (tessuto di riempimento attivo dal punto di vista metabolico e dotato di ampi spazi intercellulari) superficiale, che costituisce lo strato più esterno del fusto e delle radici delle piante legnose (alberi, viti e cespugli). In particolare, la corteccia ricopre il legno ed è costituita da una parte interna e da una parte esterna. La parte interna, che contiene tessuti vivi nei fusti maturi, include la parte più intima del periderma (tessuto di rivestimento originato dall’attività del fellogeno, che genera un tessuto parenchimatico secondario interno, non sempre presente, detto felloderma, ed un tessuto tegumentale esterno detto sughero o fellema) ed il floema (tessuto di conduzione della linfa elaborata), mentre la parte esterna, che contiene tessuti morti nei fusti maturi,
include la parte più esposta del periderma e prende anche il nome di riditoma o scorza [2].
In particolare, le pareti delle cellule del sughero contengono suberina, che favorisce la formazione di una barriera contro la disidratazione, le infestazioni da parte degli insetti e
le infezioni dovute ai batteri e alle spore fungine [3].
Nei fusti maturi possono quindi essere definiti i seguenti strati (dall’esterno): fellema, fellogeno, felloderma (limite del periderma), cortex (tessuto primario), floema (limite della
corteccia), cambio vascolare e xilema [4] [Figura 1.1].
Figura 1.1. Sezione di un fusto maturo
Nei fusti giovani la corteccia è assente e pertanto possono essere definiti i seguenti strati (dall’esterno): epiderma, periderma, cortex, floema primario, floema secondario, cambio
1.1.1. La suberina nelle pareti delle cellule suberizzate
Le pareti delle cellule suberizzate sono generalmente molto fini (meno di 1 μm di spessore) e mostrano una componente primaria, una componente secondaria ed eventualmente una componente terziaria, che confina il lume cellulare [Figura 1.2].
Figura 1.2. Parete delle cellule suberizzate osservata mediante microscopia a fluorescenza UV da Graça e
Santos [1]
Nel Quercus suber la parete cellulare è costituita da suberina (50 %), da poliaromatici (20 %) e da polisaccaridi (30 %), oltre che da estrattivi depositati sul lato più interno della parete. Gli studi topochimici hanno mostrato che i polisaccaridi ed una parte dei poliaromatici sono localizzati nelle pareti primaria e terziaria, mentre la parete secondaria, che contribuisce massimamente allo spessore della parete, contiene la suberina e la parte rimanente dei poliaromatici. Inoltre alcuni studi preliminari hanno indicato la presenza di
una parte degli estrattivi associati alla suberina all’interno della parete secondaria [1].
In particolare, la parete secondaria presenta una struttura lamellare, come indicato dal microscopio elettronico a trasmissione (TEM). Infatti, dopo un’appropriata colorazione, le lamelle mostrano un contrasto alternativamente opaco (spessore variabile tra 70 e 100 Å) e traslucente (spessore regolare di 30 Å). Peraltro il numero delle lamelle può variare da 30 a 60 e all’interno delle lamelle traslucenti sono presenti strutture perpendicolari al piano di
quest’ultime, come messo in evidenza da studi in luce polarizzata [1]. In realtà la struttura
della parete secondaria delle cellule suberizzate del Quercus suber e del Quercus cerris
potrebbe essere leggermente diversa, come messo in evidenza da Teixeira e Pereira [5]. Per
queste specie il contrasto tra le lamelle appare infatti più tenue e questo effetto potrebbe essere dovuto al diverso contenuto di suberina presente. La struttura macromolecolare potrebbe quindi possedere un arrangiamento spaziale meno denso, dovuto sia alla scarsità di glicerolo che all’abbondanza di monomeri sostituiti a metà della catena. In definitiva la struttura della parete secondaria dipende da diversi fattori, ma la composizione chimica giustifica le differenze tra le specie.
Il ruolo primario delle cellule suberizzate consiste nella ritenzione dell’acqua, poiché la suberizzazione coinvolge la deposizione di una significativa quantità di cere, che impedisce all’acqua di permeare i tessuti, ed avviene essenzialmente nei tessuti che non formano cuticole (strati idrofobici). Inoltre la suberizzazione dell’endoderma e del periderma assicura una barriera apoplastica (il trasporto diffusionale viene impedito da quella che prende il nome di “banda di Caspary”) per il trasporto dei soluti e dei gas attraverso le pareti cellulari. Infine le cellule suberizzate regolano lo scambio termico e proteggono la pianta dallo stress sia abiotico che biotico, che può essere causato dall’attacco di organismi
1.2. Composizione chimica della suberina
La suberina è un biopolimero costituito da un dominio polialifatico (SPAD) e da un dominio polifenolico (SPPD) [Figura 1.3]. In alcuni lavori il termine suberina è comunque riferito soltanto al dominio polialifatico (il dominio polifenolico viene considerato lignina),
anche se attualmente viene preferita la prima definizione, che risulta più comprensiva [1].
Inoltre viene riportata la presenza di una componente (alifatica) non polimerizzata (cera) associata al dominio polialifatico, che partecipa alla formazione della struttura
macromolecolare della suberina [8].
Figura 1.3. Struttura della suberina ipotizzata da Graça e Santos [1]
La struttura lamellare deve quindi essere ricercata nella contemporanea presenza dei domini polialifatico (lamelle traslucenti) e polifenolico (lamelle opache). I diversi domini possiedono infatti una composizione chimica caratteristica ed esistono come entità
separate, anche se appaiono legati covalentemente tra di loro [1]. Per ricostruire la struttura
macromolecolare della suberina devono quindi essere individuati i precursori monomerici di entrambi.
1.2.1. Composizione monomerica del dominio polialifatico (SPAD)
La depolimerizzazione del dominio polialifatico deve passare attraverso la rottura dei
legami esterei, comprendendo quindi reazioni di idrolisi [9,10], di alcolisi [1,11] e di
idrogenolisi [12]. In particolare, Graça e Santos [1] hanno effettuato una metanolisi della
suberina del Quercus suber catalizzata da metanolato di sodio per ottenere i monomeri da sottoporre a derivatizzazione (sililazione) al fine di effettuare l’analisi dei componenti tramite GC/MS [Tabella 1.1].
Tabella 1.1. Composizione monomerica del dominio polialifatico della suberina del Quercus suber ottenuta
tramite GC/MS da Graça e Santos [1]
Componente Composizione percentuale [%]
Glicerolo 14,2 Fenolici 0,8 Acido ferulico 0,5 Alcan-1-oli (C18 - C26) 0,4 Acidi alcanoici 1,1 Acidi alcanoici (C16 - C22) 1,0 Acidi alcanoici (C23 - C30) 0,1
Acidi alcandioci saturi 8,7
Acido esadecandioico 2,0
Acidi alcandioci saturi (C18, C20, C24, C26) 2,2
Acidi alcandioci sostituiti 36,8
Acido ottadec-9-endioico 6,2
Acido 9,10-epossiottadecandioico 22,9
Acido 9,10-diidrossiottadecandioico 7,7
Acidi alcandioici totali 45,5
Acidi ω-idrossialconoici saturi 11,4
Acido 16-idrossiesadecanoico 0,4
Acido 22-idrossidocosanoico 7,9
Acidi ω-idrossialconoici (C18, C20, C24 - C28) 3,1
Acidi ω-idrossialconoici sostituiti 14,9
Acido 18-idrossiottadec-9-enoico 5,4
Acido 9,10-epossi-18-idrossiottadecanoico 7,3
Acido 9,10,18-triidrossiottadecanoico 2,2
Acidi ω-idrossialconoici totali 26,3
Altri 1,0
Non identificati 10,7
Totale 100,0
Il glicerolo risulta uno dei componenti principali della suberina, mentre gli altri monomeri possiedono preferenzialmente una catena con 16, 18 oppure 22 atomi di carbonio. I monomeri C16 e C22 hanno generalmente una catena alchilica satura, mentre i monomeri C18 sono caratterizzati da una funzionalità a metà della catena, come un doppio legame, una funzionalità epossidica oppure una funzionalità vic-diolica. Poiché la stereochimica di
questi gruppi risulta decisiva per determinare la struttura macromolecolare, Santos et al. [13]
hanno effettuato studi spettroscopici 1H e 13C-NMR. In particolare, la configurazione dei
gruppi 9,10-epossi e 9,10-diolico presenti sugli acidi 18-idrossiottadecanoico e ottadecandioco è stata acquisita confrontando i segnali ottenuti con quelli osservati per i composti modello sintetizzati allo scopo, prima e dopo la conversione del gruppo vic-diolico ad acetale benzilidenico. La configurazione risulta pertanto cis per il gruppo 9,10-epossi e treo per quello 9,10-diolico, anche se la polarimetria ha evidenziato che sono presenti in miscela racemo. La configurazione cis per gli acidi 18-idrossiottadec-9-enoico
ed ottadec-9-endioco è stata invece confermata da Santos e Graça [14] tramite studi NMR,
FTIR, Raman e GC/MS, utilizzando l’oleato di metile e l’elaidato di metile come composti di riferimento. L’ordine stereochimico permette perciò la costruzione di una schiera organizzata di monomeri, che può essere rinforzata da legami ad idrogeno. La stereoselettività delle vie biosintetiche condiziona quindi la formazione dei gruppi ed il doppio legame dell’acido cis-oleico, che dovrebbe essere il precursore di queste specie, potrebbe subire prima un’ossidazione a cis-epossido e poi un’idrossilazione a treo-diolo. La classe dominante di monomeri è dunque costituita dagli acidi alcandioici, seguita da quella degli acidi ω-idrossialconoici. Gli alcanoli e gli acidi alcanoici sono invece presenti in quantità più piccole, anche perché non contribuiscono all’accrescimento del polimero. Inoltre la notevole partecipazione di monomeri sostituiti potrebbe essere implicata nella reticolazione del polimero, attraverso la formazione di legami tra le catene. Peraltro gli acidi alcandioici rappresentano degli indicatori diagnostici per l’identificazione della suberina (possibilità di distinzione dalla cutina), come evidenziato da Matzke e Riederer
[15]. La cutina è infatti un biopolimero simile alla suberina, che è presente nella parete
secondaria (cuticula) delle cellule vegetali, dove regola lo scambio con l’esterno. In particolare, questo poliestere ricopre, insieme alle cere (componente non polimerizzata), i
tessuti esterni di diversi organi vegetali, tra i quali le foglie ed i frutti [16]. Le differenze tra
Tabella 1.2. Differenze tra la cutina e la suberina
Proprietà Cellule cutinizzate Cellule suberizzate
Occorrenza -Organi primari (foglie e frutti) -Organi primari (ipoderma ed endoderma)
-Organi secondari (periderma delle radici) -Tessuti cicatriziali (periderma)
Struttura -Sottile strato polimerico
extracellulare
-Tessuti unicellulari (endoderma ed ipoderma) -Tessuti multicellulari (periderma ed ipoderma)
Cere Alcani, alcoli, acidi, esteri e
triterpenoidi pentaciclici (sul e nel biopolimero)
Alcani, alcoli, acidi, esteri e ferulati alchilici (nel biopolimero e soltanto nel periderma dei tessuti esposti)
Efficienza della barriera
-Alta ma non impermeabile all’acqua ed a i gas -Variabile tra le specie -Dipendente dalle cere
-Alta ma non impermeabile all’acqua ed a i gas -Variabile tra le specie
-Dipendente dalle cere
I tessuti cutinizzati ed i tessuti suberizzati sono quindi rispettivamente formati dalla cutina e dalla suberina, anche se in alcune specie è stata osservata la presenza di domini non saponificabili associati a quest’ultimi, che sono stati analogamente definiti cutano e
suberano [17]. Questi biopolimeri svolgono un ruolo simile a quello dei loro omologhi, ma
presentano una natura idrocarburica, che giustifica il diverso comportamento chimico. I risultati ottenuti dalla metanolisi alcalina graduale della suberina possono essere
relazionati alla struttura macromolecolare, come evidenziato da Lopes et al. [11] dopo
l’analisi GC/MS dei prodotti. Se le condizioni sono blande (0,01 % NaOMe) vengono rimossi preferenzialmente alcan-1-oli ed acidi alcanoici e alcandioici, mentre se sono vigorose (3,0 % NaOMe) vengono rimossi preferenzialmente acidi ω-idrossialcanoici. Da questo punto di vista è possibile ipotizzare la presenza di due distinte frazioni con diverse collocazioni nella parete cellulare e/o con differenti gradi di esterificazione. I monomeri ottenuti in condizioni blande derivano quindi dai siti più accessibili, come le estremità delle catene oppure i punti di collegamento con la matrice, mentre quelli ottenuti in condizioni vigorose riflettono la composizione dell’intero biopolimero. Inoltre la prima frazione
dovrebbe possedere un rapporto COOR/CH2 più grande rispetto alla seconda, giustificando
così la maggiore facilità di rimozione. Del resto questa teoria è confermata dagli studi
spettroscopici 13C-NMR in fase solida (SSNMR) condotti sul sughero e sugli estratti, che
indicano la presenza di due picchi principali negli spettri della suberina. Nello specifico il picco del metilene a 33 ppm (vicino alla componente polisaccaridica) scompare dopo metanolisi alcalina blanda, mentre il picco del metilene a 30 ppm viene rimosso con difficoltà. Nondimeno l’analisi osmometrica della pressione di vapore della soluzione ha permesso di rivelare la presenza di strutture ad alto peso molecolare non osservabili con un’analisi GC/MS, che potrebbero essere dovute sia ai poliaromatici (la massa molecolare aumenta con la concentrazione di NaOMe a causa delle reazioni di condensazione) che ai
polialifatici non completamente depolimerizzati. Anche Bento et al. [18] hanno constatato
tramite studi SEC (cromatografia ad esclusione dimensionale) e MALDI-MS (spettrometria di massa con ionizzazione per desorbimento laser assistita da matrice) la persistenza di frammenti oligomerici anche dopo la metanolisi. La possibilità che la depolimerizzazione risulti incompleta deve pertanto essere considerata per poter interpretare correttamente i risultati del processo.
La natura dei monomeri della suberina è stata investigata anche tramite pirolisi analitica da
Olivella e del Rio [19], che hanno condotto uno studio py-GC/MS sugli strati interni ed
esterni della corteccia della sughera, utilizzando idrossido di tetrametilammonio (TMAH) come derivatizzante. Tra le specie individuate, i monomeri C18 e C22 appaiono i più abbondanti, con una prevalenza per gli acidi ottadec-9-endioico (strati interni) e 9,10-epossiottadecandioico (strati esterni) [Tabella 1.3].
Tabella 1.3. ComposizionemonomericadelQuercussuberottenutatramitepy-GC/MSdaOlivellaedelRio[19]
Componente Strati interni Strati esterni
Acido esadec-8-enoico 0,3 0,5 Acido ferulico 5,9 7,0 Acido esadecanoico 0,4 0,5 Acido ottadec-9,12-dienoico 0,9 1,5 Acido ottadec-9-enoico 0,2 0,3 Acido ottadecanoico 0,1 0,2 Acido 16-idrossiesadecanoico 0,3 0,2 Eicosan-1-olo 0,6 1,0 Acido esadecandioico 5,4 2,8 Acido eicosanoico 0,3 0,2 Acido 18-idrossiottadec-9-endioico 4,1 3,2 Acido ottadec-9-endioico 19,2 15,1 Acido ottadecandioico 2,0 1,4 Acido docosanoico 5,3 6,5 Acido 18-idrossi-9,10-epossiottadecanoico 1,1 1,4 Acido 20-idrossieicosanoico 0,4 0,3 Acido 10-idrossiottadec-9-endioico 1,7 1,2 Acido 9,10-epossiottadecandioico 9,6 11,6 Acido eicosandioico 3,6 3,2 Acido 9,10-diidrossiottadecandioico 3,3 3,1 Acido tetracosanoico 2,9 5,3 Acido 22-idrossidocosanoico 4,2 5,0 Acido 9,10,18-triidrossiottadecanoico 9,0 6,3 Acido docosandioico 15,9 16,1 Acido esacosandioico 0,1 0,5 Acido 24-idrossitetracosanoico 1,2 2,3 Acido tetracosandioico 2,0 3,4
Sebbene la distribuzione sia simile a quella ottenuta per depolimerizzazione tramite metanolisi, sono comunque presenti delle differenze, che portano a sovrastimare la presenza degli acidi ottadec-9-endioico e docosandioico e a sottostimare quella dell’acido
9,10-epossiottadecandioico rispetto a quanto affermato da Graça e Santos [1].
La variabilità della composizione della suberina proveniente sia da sugheri vergini (raccolto dopo 25-30 anni) che da sugheri rigenerati (raccolto ogni 9 anni) di Quercus suber è stata
peraltro studiata da Bento et al. [20] tramite py-GC/MS in presenza di idrossido di
tetrametilammonio (TMAH) come derivatizzante. I risultati conseguiti riportano anche in questo caso una notevole variabilità, anche se i profili appaiono piuttosto simili se vengono confrontate le classi chimiche anziché i singoli monomeri [Tabella 1.4]. Da questo punto di vista le differenze tra quest’ultimi potrebbero essere dovute a condizioni specifiche all’interno dei processi metabolici e non ad una diversa produzione dei precursori.
Tabella 1.4. Coefficienti di variazione (in percentuale) degli acidi C18 presenti nel sughero del Quercus
suber (12 campioni provenienti da 5 siti) ottenuti tramite py-GC/MS da Bento et al. [20]
Componente CV sugheri vergini [%] CV sugheri rigenerati [%]
Acido 18-idrossiottadec-9-enoico 36 43 Acido 9,10-epossi18-idrossiottadecanoico 16 30 Acido 9,10-epossiottadecanoico 20 15 Acido 9,10,18-triidrossiottadecanoico 60 25 Acido ottadec-9-endioico 49 35 Acido 9,10-diidrossiottadecandioico 53 35 Totale 7 7
In generale, sono state comunque osservate maggiori differenze per i sugheri vergini che per quelli rigenerati.
La composizione monomerica della suberina proveniente da 16 specie di piante superiori è
stata inoltre determinata da Holloway [21] tramite GC/MS dopo depolimerizzazione con
NaOMe/MeOH in presenza di AcOMe. Nello specifico il contenuto di suberina presente nelle 16 specie varia dall’8 al 60 % della massa secca della corteccia priva di estrattivi. In ogni caso sono evidenti variazioni significative nelle proporzioni relative delle classi monomeriche, anche se gli acidi ω-idrossialcanoici appaiono comunque componenti fondamentali per la costruzione di questo biopolimero [Tabella 1.5].
Tabella 1.5. Composizione monomerica (in massa percentuale) della suberina della corteccia di 16 piante
superiori (A = alcan-1-oli (C18-C32), B = acidi alcanoici (C16-C32), C = acidi alcandioici (C16-C32), D = acidi ω-idrossialcanoici (C16-C32), E = acido diidrossiesadecanoico, F = acido 9,10-epossi-18-idrossiottadecanoico, G = acido 9,10,18-tri9,10-epossi-18-idrossiottadecanoico, H = acido 9,10-epossiottadecandioico e I = acido 9,10-diidrossiottadecandioico) ottenuta tramite GC/MS da Holloway [21]
Specie A B C D E F G H I Quercus robur 2,3 2,0 4,7 21,3 3,7 22,7 25,3 3,5 6,9 Quercus ilex 5,6 6,0 2,6 23,9 0,7 16,6 16,6 4,4 3,5 Fagus sylvatica 6,8 4,4 8,4 18,7 0,8 26,4 26,4 0,5 3,0 Castanea sativa 3,9 1,1 1,7 13,4 2,2 31,9 31,9 3,1 5,1 Betula pendula tr tr 8,0 21,6 4,2 29,1 29,1 tr tr Quercus suber 2,3 1,3 9,0 40,7 tr 5,4 5,4 15,9 7,8 Acer griseum 2,0 10,7 5,9 39,6 0,3 10,9 10,9 2,9 17,1 Fraxinus excelsior 9,5 7,9 15,2 24,3 tr 4,5 4,5 11,3 13,6 Acer pseudoplatanus 4,7 2,8 17,0 54,3 2,8 3,5 3,5 1,3 2,2 Ribes nigrum 6,2 4,0 20,2 49,7 2,9 1,6 1,6 tr tr Euonymus alatus 1,5 6,2 24,0 61,2 0,8 1,6 1,6 tr tr Populus tremula 2,3 6,2 27,1 54,5 1,9 1,1 1,1 tr 0,7 Solanum tuberosum 11,1 8,2 32,7 31,7 tr tr tr tr 1,5 Sambucus nigra 6,1 6,7 23,7 50,5 0,6 0,8 0,8 tr 0,3 Laburnum anagyroides 1,5 1,5 27,1 48,6 9,4 1,2 1,2 tr 0,1 Cupressus leylandii 3,6 9,4 31,5 51,2 0,4 tr tr tr 0,1
Gli acidi ω-idrossialcanoici rappresentano il 40-50 % dei monomeri totali in 9 specie (Ribes
nigrum, Euonymus alatus, Populus tremula, Sambucus nigra, Laburnum anagyroides, Cupressus leylandii, Quercus suber, Acer griseum e Acer pseudoplatanus), mentre gli acidi
alcandioici il 20-30 % in 7 specie (Ribes nigrum, Euonymus alatus, Populus tremula,
Solanum tuberosum, Sambucus nigra, Laburnum anagyroides e Cupressus leylandii).
Inoltre gli acidi epossiidrossialcanoici e triidrossialcanoici arrivano fino al 55 % dei monomeri totali in 4 specie (Quercus suber, Quercus ilex, Fagus sylvatica e Castanea
sativa), mentre gli acidi epossialcandioici e diidrossialcandioici sono importanti soltanto
per 3 specie (Quercus suber, Acer griseum e Fraxinus excelsior). Infine gli alcan-1-oli (11 % nel Solanum tuberosum) e gli acidi alcanoici (11 % nell’Acer griseum) e diidrossialcanoici (9 % nel Laburnum anagyroides) possono essere classificati come componenti secondari della suberina.
1.2.2. Composizione dimerica del dominio polialifatico (SPAD)
La composizione dei dimeri generati dalla depolimerizzazione parziale della suberina del
Quercus suber per metanolisi catalizzata da idrossido di calcio è stata studiata da Graça e
Santos [9] effettuando uno studio dei prodotti tramite ESI-MS2 (spettrometria di massa in
tandem con ionizzazione elettrospray). I dimeri sono stati identificati anche attraverso il confronto tra gli spettri di massa ottenuti e quelli dei composti modello sintetizzati allo scopo e sono stati individuati sia esteri tra un acido alcandioico ed uno ω-idrossialcanoico
che esteri tra due acidi ω-idrossialcanoici, con una prevalenza di acidi C18 sostituiti a metà della catena [Tabella 1.6].
Tabella 1.6. Composizione dimerica del dominio polialifatico della suberina del Quercus suber (Id = acido
ω-idrossialcanoico, DiC = acido alcandioico, epox = epossido, diol = diolo) ottenuta tramite ESI-MS2 da
Graça e Santos [9]
Estere dimerico Massa monoisotopica [m/z] Intensità relativa
Id18:1-Id18:1 592,5 24 Id16-DiC18:1 594,5 27 Id18:1-DiC16 Id18epox-Id18:1 608,5 33 Id18:1-Id18epox Id16-DiC18epox 610,5 28 Id18epox-DiC16 Id18:1-DiC18:1 620,5 38 Id18epox-Id18epox 624,5 26 Id18diol-Id18:1 626,5 25 Id18:1-Id18diol Id18epox-DiC18:1 636,5 88 Id18:1-DiC18epox Id18:1-Id22 650,6 27 Id22-Id18:1 Id18epox-DiC18epox 652,5 100 Id18:1-DiC18diol 654,5 59 Id18diol-DiC18:1 Id18epox-Id22 666,6 30 Id22-Id18epox Id18diol-DiC18epox 670,5 56 Id18epox-DiC18diol Id22-DiC18:1 678,6 32 Id18:1-DiC22 Id22-Id18diol 684,6 41 Id18diol-Id22 Id18diol-DiC18diol 688,5 39 Id22-DiC18epox 694,6 37 Id18epox-DiC22 Id22-Id22 708,7 22 Id18diol-DiC22 712,6 30 Id22-DiC18diol
L’abbondanza relativa dei dimeri può essere stimata dall’intensità relativa dei picchi
[Tabella 1.6], che mostra come gli esteri tra un acido alcandioico ed uno ω-idrossialcanoico
siano più comuni rispetto agli esteri tra due acidi ω-idrossialcanoici, anche se devono essere considerate le sovrapposizioni tra gli isomeri e le eventuali differenze di ionizzabilità delle specie. Peraltro i monomeri presenti nei dimeri osservati seguono approssimativamente l’ordine di abbondanza relativa individuato per i monomeri che derivano dalla
depolimerizzazione totale della suberina, tralasciando quelli saturi [9].
1.2.3. Composizione oligomerica del dominio polialifatico (SPAD)
La composizione degli oligomeri ottenuti dalla depolimerizzazione parziale della suberina del Quercus suber per metanolisi catalizzata da idrossido di calcio è stata studiata da Graça
e Santos [10] tramite ESI-MS2. In particolare, gli oligomeri identificati contengono almeno
una molecola di glicerolo e possono essere divisi in quattro classi: esteri monoacilglicerolici di acidi alcanoici (dimeri), diesteri diglicerolici di acidi alcandioici
(trimeri), esteri diacilglicerolici di acidi alcandioici (trimeri) ed esteri monoacilglicerolici di esteri di acidi ω-idrossialcanoici ed alcandioici (trimeri). Inoltre è stata osservata la presenza di trimeri contenenti glicerolo, un acido ω-idrossialcanoico e acido ferulico
[Tabella 1.7].
Tabella 1.7. Composizione oligomerica del dominio polialifatico della suberina del Quercus suber (C = acido
alcanoico, Id = acido ω-idrossialcanoico, DiC = acido alcandioico, Gly = glicerolo, Fer = acido ferulico, epox = epossido, diol = diolo) ottenuta tramite ESI-MS2 da Graça e Santos [10]
Gliceride Massa monoisotopica [m/z] Intensità relativa
Glicerolo-Monoacido Gly-C22 414,4 11,8 Glicero-Acido ω-idrossialcanoico Gly-Id16 346,3 9,3 Gly-Id18:1 372,3 19,9 Gly-Id18epox 388,3 11,5 Gly-Id18diol 406,6 8,2 Gly-Id22 403,4 17,7 Gly-Id24 458,4 18,2
Glicerolo-Acido alcandioico (Me)
Gly-DiC16 374,3 61,1 Gly-DiC18 402,3 15,5 Gly-DiC22 458,4 18,2 Gly-DiC18:1 400,3 22,9 Gly-DiC18epox 416,3 37,5 Gly-DiC18diol 434,3 25,4 Glicerolo-Acido alcandioico-Glicerolo Gly-DiC16-Gly 434,3 25,4 Gly-DiC18-Gly 462,3 5,5 Gly-DiC22-Gly 518,4 4,7 Gly-DiC18epox-Gly 476,3 4,5 Gly-DiC18diol-Gly 494,3 32
(Me) Acido alcandioico-Glicerolo-Acido alcandioico (Me)
DiC18:1-Gly-DiC18epox 724,5 3,7
DiC18epox -Gly-DiC18epox 740,5 4,9
Glicerolo-(Acido ω-idrossialcanoico-Acido alcandioico o viceversa (Me))
Gly-Id18:1-DiC18epox 696,5 6,0 Gly-DiC18:1-Id18epox 696,5 Gly-Id18epox-DiC18:1 696,5 Gly-DiC18epox-Id18:1 696,5 Gly-Id18epox-DiC18epox 712,5 7,8 Gly-Dic18epox-Id18epox 712,5 Gly-Id18epox-Dic18diol 730,5 4,4 Gly-Dic18epox-Id18diol 730,5 Gly-Id18diol-Dic18epox 730,5 Gly-Id18diol-Id18epox 730,5
Glicerolo-Acido ω-idrossialcanoico-Acido ferulico
Gly-Id16-Fer 522,3 2,4
Gly-Id22-Fer 606,4 5,3
Gly-Id24-Fer 634,4 4,0
Anche in questo caso l’abbondanza relativa degli oligomeri può essere stimata dall’intensità relativa dei picchi, sebbene debbano essere considerate le sovrapposizioni tra gli isomeri e le eventuali differenze di ionizzabilità delle specie. Inoltre, la prevalenza degli acidi alcandioici e ω-idrossialcanoici riprende analogamente l’importanza di questi
L’estrazione specifica ed efficiente di frammenti oligomerici e polimerici è stata inoltre
effettuata da Ferreira et al. [22] attraverso l’impiego di liquidi ionici come solventi. In
particolare, le caratteristiche di diversi liquidi ionici (esanoato di 1-etil-3-metilimidazolio, esanoto di colinio, ottanoato di colinio e decanoato di colinio) sono state confrontate, focalizzando l’attenzione sulla basicità e sulla lunghezza delle catene alchiliche degli anioni e sulle interazioni elettrostatiche tra gli ioni. Tra questi è stato scelto l’esanoato di colinio
[Figura 1.4] in base all’efficienza di estrazione, che è stata valutata tramite analisi
ATR-FTIR. In particolare, la biocompatibilità e la biodegradabilità di questo liquido ionico presentano interessanti prospettive per applicazioni sostenibili da un punto di vista
ambientale [23]. C H3 O O- H3C N+ CH3 C H3 OH
Figura 1.4. Struttura dell’esanoato di colinio
La caratterizzazione dei prodotti è stata effettuata da Ferreira et al. [24] tramite studi
ATR-FTIR, 13C-CP/MAS-SSNMR, GC/MS, TGA (analisi termogravimetrica) e DSC
(calorimetria a scansione differenziale), evidenziando strutture altamente reticolate, con una composizione monomerica analoga a quella determinata in seguito ad una depolimerizzazione totale della suberina e con un comportamento termico simile a quello del materiale originario. Tuttavia è stato osservato che le funzionalità epossidiche tendono ad idrolizzarsi durante l’estrazione, probabilmente a causa della presenza del liquido ionico, inficiando parzialmente la possibilità di studiare la struttura nativa del biopolimero. L’estrazione con un altro liquido ionico, il cloruro di 1-allil-3-metilimidazolio ([Amim]Cl),
è stata invece condotta da Mattinen et al. [25] sia sul dominio polialifatico che sul dominio
polifenolico della suberina del Solanum tuberosum, dopo aver purificato il rivestimento di questo tubero con cellulasi e pectinasi. La caratterizzazione dei prodotti è stata effettuata sia in fase solida, tramite studi FTIR e DSC (calorimetria a scansione differenziale), che in
soluzione, tramite studi 31P-NMR (dopo fosforilazione) e GPC (cromatografia a
permeazione di gel).
La ricostruzione del biopolimero sotto forma di film è stata infine realizzata da Garcia et al. [26] attraverso l’impiego di esanoato di colinio come solvente di estrazione, rimarcando la possibilità di conservare parzialmente le caratteristiche chimiche della suberina nativa, insieme alle proprietà antimicrobiche di questa barriera.
1.2.4. Composizione monomerica del dominio polifenolico (SPPD)
Quando il dominio polialifatico viene depolimerizzato, anche alcune specie aromatiche vengono cosolubilizzate in quantità variabili, in dipendenza delle condizioni adottate dalla procedura (primariamente acido ferulico [Figura 1.5] e secondariamente feruloilammine e diferulati). Nel residuo ottenuto dal processo precedente rimane inoltre una quantità significativa di poliaromatici, che sono dovuti alla partecipazione del dominio polifenolico.
O MeO
O H
OH
Figura 1.5. Struttura dell’acido ferulico (classificabile sia come acido idrossicinnamico che come
In accordo con gli studi spettroscopici CP/MAS (polarizzazione incrociata con rotazione
all’angolo magico) 13C-SSNMR effettuati da Bernards et al. [27,28], le popolazioni di
poliaromatici presenti nelle pareti delle cellule suberizzate sono di due tipi. In particolare, la maggior parte dei poliaromatici associati alla suberina consiste in poli(acido ferulico),
mentre la parte rimanente è lignina di tipo guaiacilico [29] (visto che il monomero è l’alcol
coniferilico). Sia l’alcol coniferilico che l’acido ferulico sono fenilpropanoidi, che risultano monometossilati sull’anello fenolico. Le due popolazioni sono comunque caratterizzate da
un diverso tempo di rilassamento spin-reticolo (T1), suggerendo che quella che include gli
anelli fenolici di tipo guaiacilico e sinapilico (dimetossilati) possa essere associata alla componente polisaccaridica delle pareti primaria e terziaria.
In generale, l’ipotesi che i tessuti suberizzati contengano una quantità significativa di acidi idrossicinnamici ed una quantità relativamente più piccola di monolignoli rispetto ai tessuti
lignificati è stata avvalorata da una serie di studi condotti su diversi tessuti [6]. I profili per
i tessuti lignificati e suberizzati appaiono infatti diversi tra di loro e caratterizzati da una diminuzione di monolignoli passando dai primi ai secondi.
L’acido ferulico, come evidenziato dalla depolimerizzazione parziale della suberina, risulta pertanto un tassello importante per la comprensione dei legami che esistono tra i domini polialifatico e polifenolico.
1.2.5. Composizione degli estrattivi
Gli estrattivi costituiscono la componente non polimerizzata (cera) associata al dominio polialifatico della suberina e rappresentano una frazione significativa della massa totale. In
particolare, nel Quercus suber il contenuto di estrattivi arriva al 14,2 % [30], mentre nella
Betula pendula addirittura al 40 % [31]. La distribuzione di questa componente varia quindi tra le specie, raggiungendo il 9,6 % della massa totale nel Quercus variabilis, l’11,1 % nel
Calotropis procera, il 16,7 % nel Quercus cerris ed il 23 % nella Kielmeyera coriacea [32].
La composizione degli estrattivi può essere studiata estraendo in soxhlet le cortecce
polverizzate prima con diclorometano, poi con etanolo ed infine con acqua [32]. La frazione
corrispondente al diclorometano contiene essenzialmente acidi alcanoici ed alcanoli, ma anche alcani, oltre ai monomeri non polimerizzati del corrispettivo dominio polialifatico. Nel Quercus suber i triterpenoidi friedelina e cerina contribuiscono con percentuali tra il
20 ed il 40 % alla massa totale degli estrattivi in questo solvente [33], mentre nella Betula
pendula il betulino e l’acido betulinico sono i triterpenoidi principali [31]. La frazione
corrispondente all’etanolo contiene invece residui metabolici (come glicerolo e zuccheri) ed alifatici non estratti dal diclorometano. La frazione corrispondente all’acqua contiene infine soltanto una piccola percentuale degli estrattivi totali.
1.3. Struttura tridimensionale della suberina
Le informazioni strutturali sulla suberina derivano dai blocchi oligomerici ottenuti dalla depolimerizzazione parziale di quest’ultima e dagli studi spettroscopici SSNMR condotti
sul biopolimero intatto [1].
In particolare, i frammenti oligomerici possono essere di varia natura e, sebbene rappresentino circa il 10 % della massa secca della suberina, possono fornire una visione approssimativa della struttura macromolecolare di quest’ultima. La rete polimerica tridimensionale appare fondata sui legami esterei prodotti dal glicerolo, come mostrato dalle proporzioni molari relative tra quest’ultimo e gli acidi alcandioici, che rappresentano quindi la principale controparte acilica dei gliceridi. Inoltre anche l’acido ferulico risulta essenziale per la connessione dei diversi domini polialifatico e poliaromatico, legandosi sia al glicerolo che agli acidi ω-idrossialcanoici [Figura 1.6].
Figura 1.6. Struttura della suberina e della parete primaria (S = suberina, C = carboidrati e P = fenolici)
ipotizzata da Bernards [6]
Le osservazioni SSNMR hanno anche rilevato la presenza di due distinte popolazioni di atomi di carbonio alifatici, che risultano caratterizzate da differenti spostamenti chimici, risposte a sequenze di disaccoppiamento ritardato e tempi di rilassamento spin-reticolo. Una parte minoritaria dei metileni alchilici mostra una notevole flessibilità, mentre la parte rimanente presenta una mobilità ridotta. Nello specifico la prima è riscontrabile nelle catene più corte vicine ai poliaromatici (glicerolo), mentre la seconda nelle catene più lunghe (acidi).
In ogni caso esiste una considerevole variabilità nella struttura della suberina e la causa principale di questo effetto è legata alla presenza dei sostituenti a metà delle catene dei monomeri, che possono instaurare interazioni secondarie sia covalenti che dipolari (legami ad idrogeno).
1.4. Biosintesi della suberina
La biosintesi dei monomeri di entrambi i domini non è stata ancora completamente compresa, anche se qualche dettaglio è comunque disponibile. La maggior parte degli studi comprende i tessuti cicatriziali del Solanum tuberosum, ovvero della patata, come sistema
modello [6], anche se una piccola parte dei lavori coinvolge l’Arabidopsis thaliana [34]. In
particolare, uno schema biosintetico semplificato è stato proposto da Franke e Schreiber [7]
sulla base delle osservazioni condotte su questa pianta, riportando sia gli stadi conosciuti che quelli ipotizzati [Figura 1.7].
Figura 1.7. Schema biosintetico semplificato (con stadi noti ed ipotizzati) della suberina (dove l’apoplasto è
l’insieme delle pareti che non sono state rese impermeabili all’acqua mediante modificazioni con sostanze idrofobe ed il simplasto è l’insieme dei protoplasti (unità cellulari) comunicanti tra di loro) proposto da Franke e Schreiber [7]
In definitiva sia i componenti alifatici che quelli aromatici derivano dai prodotti del metabolismo dei carboidrati ed in particolare dal piruvato, dall’enolpiruvato-fosfato e dall’eritrosio-4-fosfato. La distinzione tra alifatici ed aromatici avviene quando la sintesi degli acidi grassi e la via dello scichimato cominciano, poiché la prima conduce agli acidi esadecanoico ed ottadecanoico (precursori degli alifatici), mentre la seconda alla fenilalanina (precursore dei fenilpropanoidi). Inoltre le reazioni fondamentali includono l’ossidazione e l’elongazione degli acidi grassi, che, insieme a quelle che coinvolgono i derivati dell’idrossicinnamoil-Coenzima A (CoA), regolano la produzione dei monomeri.
Per quanto riguarda le reazioni di ossidazione dei carboni terminali, a causa dei diversi monomeri presenti, è necessario ammettere che gli enzimi coinvolti non siano specifici oppure che sia coinvolta una famiglia di enzimi che discrimini in base alla lunghezza delle catene oppure al grado di ossidazione. Oltre a queste considerazioni, l’ossidazione dei carboni a metà della catena (preferenzialmente dell’acido ottadecanoico) permette di ipotizzare una sequenza idrossilativa che parte dal carbonio centrale più vicino alla funzionalità carbossilica (il 9 per l’acido ottadecanoico) e prosegue su quello centrale adiacente oppure su quello terminale (in ω). L’ossidazione può dunque avanzare fino all’ottenimento degli acidi alcandioici, passando attraverso la formazione dell’epossido. Per quanto riguarda le reazioni di elongazione è stato invece osservato che coinvolgono principalmente l’acido ottadecanoico, portando alla produzione degli acidi docosanoico e tetracosanoico.
Gli altri monomeri comprendono il glicerolo, che è un intermedio metabolico comune, i ferulati, che sono prodotti da una feruloioltransferasi, e gli acidi idrossicinnamici, che potrebbero derivare dai corrispondenti esteri-CoA. In particolare, il metabolismo dei fenilpropanoidi può essere assimilato alla biosintesi dei monolignoli, che conduce alla formazione della lignina, anche se vengono comunque incorporati precursori addizionali (oltre ai tre monolignoli) durante la formazione del dominio poliaromatico.
In ogni caso i meccanismi che guidano l’assemblaggio di questo biopolimero sono ancora
poco noti, benché siano state formulate delle ipotesi plausibili [35]. Per quanto riguarda il
dominio polialifatico è infatti possibile assumere che il poliestere derivi dal trasferimento dei precursori acil-CoA agli appropriati accettori (glicerolo e acidi ω-idrossialcanoici) all’interno della matrice, in modo analogo a quanto avviene per la cutina. Gli acidi fenolici (principalmente acido ferulico e acido p-cumarico) potrebbero invece essere incorporati come esteri-CoA oppure come glicosidi. In definitiva le transferasi e le trasformazioni associate non sono attualmente conosciute, ma l’uniformità e la regolarità del polimero (lamelle della suberina) suggeriscono una costruzione orchestrata e mediata da enzimi,
piuttosto che un assemblaggio casuale [6].
1.5. Usi ed applicazioni della suberina
La suberina viene sfruttata sotto forma di sughero per la produzione di numerosi manufatti, tra i quali primeggiano i tappi di bottiglia per la conservazione dei vini. Il sughero viene inoltre impiegato in numerose applicazione tecnologiche, grazie alle caratteristiche peculiari delle cellule suberizzate, che assicurano una bassa densità, una scarsa permeabilità ai gas ed all’acqua, una ridotta conducibilità termica, una grande elasticità ed una notevole stabilità chimica. In particolare, i materiali compositi a base di sughero vengono prodotti dall’agglutinamento dei granuli, utilizzando diversi tipi di legante, tra i quali spiccano le
gomme sintetiche e le resine fenoliche, poliuretaniche ed epossidiche [1]. Un’altra
applicazione interessante consiste nell’ossipropilazione della polvere di sughero, che porta
alla formazione di schiume poliuretaniche [36]. I prodotti ottenibili dalla suberina sono stati
anche impiegati per la sintesi di farmaci (inibizione della mutagenesi [37] ed assorbimento
dei carcinogeni [38]) e la produzione di cosmetici (azione levigante sulla pelle [39]), di additivi
per gli inchiostri [40] e di polimeri [41-45]. Nello specifico i monomeri e gli estrattivi della
suberina possono essere sfruttati, sia direttamente che dopo purificazione, come precursori,
anche in presenza di comonomeri, di poliuretani [41,42] e di poliesteri [43]. In quest’ottica sono
state sviluppate diverse strategie ecocompatibili per la produzione di poliesteri, utilizzando
condizioni blande, microonde oppure enzimi [44,45]. Sousa et al. [46] hanno appunto
sintetizzato due tipi di poliestere a partire dalla policondensazione e dalla politransesterificazione in condizioni blande di frammenti di suberina provenienti da due diverse fonti vegetali (Quercus suber e Betula pendula). La produzione di film polimerici
di suberina con proprietà antibatteriche è stata peraltro compiuta da Garcia et al. [26], impiegando esanoato di colinio come solvente di estrazione.
In conclusione, la suberina potrebbe diventare una materia prima interessante per la produzione di nuovi materiali con un basso impatto in termini di sostenibilità ambientale e di costi di produzione. Gli scarti ricchi di suberina provenienti dalla lavorazione del legno
(circa 40000 ton/y di polvere di sughero soltanto in Portogallo [1]) potrebbero pertanto
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43. Lipase-catalyzed synthesis of an epoxy-functionalized polyester from the suberin
monomer cis-9,10-epoxy-18-hydroxyoctadecanoic acid, A. Olsson, M. Lindström, T.
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44. Synthesis of aliphatic suberin-like polyesters by ecofriendly catalytic systems, A. F.
Sousa, A. J. D. Silvestre, A. Gandini, C. Pascoal Neto, High Perform. Polym., 24 (2012) 4
45. Lipase-Catalyzed Synthesis of an Epoxy-Functionalized Polyester from the Suberin
Monomer cis-9,10-Epoxy-18-hydroxyoctadecanoic Acid, A. Olsson, M. Lindström, T.
Iversen, Biomacromolecules, 8 (2007) 757
46. Novel Suberin-Based Biopolyesters: From Synthesis to Properties, A. F. Sousa, A.
Gandini, A. J. D. Silvestre, C. P. Neto, J. J. C. Cruz Pinto, C. Eckerman, B. Holmbom,
2. Materiali, strumenti e metodi
In questo capitolo vengono descritti i materiali utilizzati e presentati gli strumenti ed i metodi analitici adottati per condurre lo studio sulla suberina.
2.1. Raccolta e trattamento dei campioni
I campioni di corteccia (Betula pendula, Quercus suber, Quercus robur, Quercus ilex,
Castanea sativa, Carpinus betulus, Fagus sylvatica e Populus nigra) utilizzati per le
ricerche condotte nell’ambito di questa tesi, sono stati prelevati da diverse zone della Toscana e catalogati con un codice [Tabella 2.1 e Figura 2.1].
Tabella 2.1. Campioni di corteccia con relativi codici, date e luoghi di raccolta
Specie Codice Data di raccolta Luogo di raccolta
Betula pendula BP 26/11/2013 Ponsacco (PI)
Quercus suber QS 06/10/2013 Marina di Castagneto Carducci (LI)
Quercus robur QR 06/10/2013 Marina di Castagneto Carducci (LI)
Quercus ilex QI 20/11/2013 Crespina (PI)
Castanea sativa CS 25/10/2013 Corfino (LU)
Carpinus betulus CB 03/11/2013 Chianni (PI)
Fagus sylvatica FS 25/10/2013 Cutigliano (LU)
Populus nigra PN 05/11/2013 Lavaiano (PI)
Figura 2.1. Luoghi di raccolta dei campioni di corteccia
Per allontanare parte dell’umidità, tutte le cortecce sono state lasciate in stufa a 60 °C per una notte, polverizzate tramite un mulino a palle Mini-Mill Pulverisette 23 (Fritsch, Germania) ed inserite in vials di vetro fino al momento dell’analisi.
2.2. Reagenti
Per la preparazione dei campioni da studiare tramite GC/MS sono stati impiegati metanolo, etanolo, acqua bidistillata (Carlo Erba, Italia), metanolato di sodio in metanolo 0,5 M ed idrossido di potassio per l’idrolisi, esano, dietiletere ed acido cloridrico concentrato (diluito con acqua bidistillata (Carlo Erba, Italia)) per l’estrazione ed acido tridecanoico (C13) (purezza maggiore del 99 %), N,O-bis(trimetilsilil)trifluoroacetammide (BSTFA) con
trimetilclorosilano (TMCS) all’1 % (purezza maggiore del 97 %) ed isoottano per HPLC per la derivatizzazione.
Per la preparazione dei campioni da studiare tramite DE-MS sono stati adoperati diclorometano, etanolo ed acqua bidistillata (Carlo Erba, Italia).
Per la preparazione dei campioni da studiare tramite FIA-ESI-MS sono stati utilizzati metanolo per HPLC, isopropanolo per HPLC ed idrossido di calcio.
Per la derivatizzazione dei campioni da studiare tramite py-GC/MS è stato utilizzato esametildisilazano (HMDS) (purezza al 99,9 %).
Per la preparazione dei campioni da studiare tramite FT-IR è stato impiegato bromuro di potassio essiccato.
Dove non specificato, i reagenti sono stati acquisiti dalla Sigma Aldrich (USA).
2.3. Strumenti
GC/MS: è stato impiegato un gas-cromatografo 6809N-Network GC system (Agilent
Technologies) munito di vaporizzatore a temperatura programmata (iniettore PTV) ed
interfacciato con uno spettrometro di massa 5975 (Agilent Technologies) con analizzatore a singolo quadrupolo. La separazione cromatografica è stata effettuata con una colonna capillare in silice fusa chimicamente legata HP-5MS (Agilent Technologies) con fase stazionaria costituita da 5 % difenil - 95 % metilpolisilossano, diametro interno 0,25 mm, spessore del film 0,25 µm e lunghezza 30 m collegata mediante un press-fit in quarzo ad una precolonna in silice fusa disattivata con diametro 0,32 mm e lunghezza 2 m (Agilent
Technologies).
La separazione cromatografica è stata realizzata mantenendo l’iniettore a 280 °C (modalità splitless), il flusso del gas di trasporto (elio con purezza al 99,995 %) a 1,3 mL/min e l’interfaccia a 280 °C. La programmata di temperatura applicata può essere schematizzata dalla tabella seguente [Tabella 2.2]:
Tabella 2.2. Programmata di temperatura impiegata per lo svolgimento delle analisi tramite GC/MS
Fase Velocità [°C/min] Temperatura [°C] Mantenimento [min]
0 80 2
1 10 200 4
2 6 280 50
La rivelazione con spettrometria di massa è stata invece effettuata mantenendo la sorgente a 230 °C e l’analizzatore (quadrupolo) a 150 °C e lavorando tra 50 e 650 m/z in modalità TIC (0,41 s/ciclo).
L’idrolisi dei campioni da studiare tramite GC/MS è stata condotta con un forno a microonde MLS-1200 MEGA (Milestone Microwave Laboratory System) dotato di tecnologia MDR (High Performance Microwave Digestion) e di modulo per l’evacuazione dei vapori Exhauste Module EM-45/A.
EGA-MS: è stato impiegato un pirolizzatore EGA/PY-3030D (Frontier Lab) interfacciato con uno spettrometro di massa 5973 (Agilent Technologies) con analizzatore a singolo quadrupolo.
