CONCLUSIONI
La FAAH (fatty acid amide hydrolase) è il principale enzima deputato alla degradazione dell’anandamide, ligando endogeno dei recettori CB1 e CB2, e di altre etanolammidi bioattive. Essa è considerata un importante obbiettivo farmacologico, soprattutto in quelle patologie che possono beneficiare di un aumento del tono endocannabinoide. La sua inattivazione ha dimostrato effetti terapeutici in numerosi studi preclinici, con potenziali applicazioni nel trattamento dell’infiammazione, del dolore neuropatico, delle malattie neurodegenerative, della depressione e dei disturbi metabolici e cardiovascolari.
L’utilizzo di inibitori selettivi verso questo enzima è emerso come un approccio in grado di aumentare il tono endocannabinoide in maniera evento-specifica, riducendo allo stesso tempo gli effetti psicotropi dati dall’uso prolungato di agonisti diretti dei recettori cannabionidi. Numerose serie di inibitori sono note ad oggi in letteratura, quasi tutte caratterizzate dalla presenza di un carbonio elettrofilo in grado di legarsi covalentemente alla serina catalitica dell’enzima, in modo reversibile o irreversibile. La maggior parte di esse mostra selettività per la FAAH nei tessuti cerebrali, ma possiede target addizionali in tessuti periferici come fegato e rene, tra cui molti isoenzimi coinvolti nel metabolismo di farmaci e profarmaci. La scoperta e lo sviluppo di inibitori prettamente non covalenti si pone come una valida strategia per cercare di migliorare il profilo di selettività e sicurezza mostrato dalle altre classi di inibitori, ed è stato perciò l’obbiettivo del nostro studio.
La ricerca bibliografica ha portato alla luce un numero abbastanza esiguo di inibitori non covalenti. Attualmente sono disponibili soltanto due strutture cristallografiche della FAAH complessata con un inibitore di questo tipo: l’inibizione è ottenuta primariamente per complementarietà di forma con il sito attivo e attraverso numerose interazioni idrofobiche, mentre non sono presenti legami ad idrogeno con determinati residui amminoacidici.
81 La prima parte del progetto è stata dedicata all’elaborazione di una procedura di virtual screening attraverso il programma FLAP, che consentisse di sfruttare al meglio le informazioni raccolte in letteratura sul recettore e gli inibitori di tipo non covalente. Questo software è in grado di esplorare lo spazio farmacoforico 3D di proteine e ligandi e di fornire informazioni quantitative e qualitative sulla complementarietà delle loro interazioni. Sono stati testati sia approcci di tipo ligand-based (LB) che receptor-based (RB); per tale scopo è stato creato un database di calibrazione, costituito da 43629 molecole appartenenti al database MUV e da 6 inibitori non covalenti della FAAH, caratterizzati da un IC50 compresa tra 1 nM e 10 nM. Questi ultimi sono stati utilizzati come templati di riferimento per i calcoli LB, mentre per quelli RB è stata considerata la struttura cristallografica della h/r FAAH (codice PDB= 3OJ8). Questa fase del lavoro è stata effettuata per capire quale fosse l’approccio di screening più efficacie per la ricerca di nuovi inibitori della FAAH, prima di effettuare una ricerca vera e propria all’interno di un database commerciale.
Le differenti procedure di virtual screening sono state valutate sulla base della loro abilità nel separare le molecole attive dalle presunte inattive, attraverso l’analisi degli enrichment plot ottenuti. Questi grafici mettono in relazione il numero degli attivi ritrovati con il numero totale delle molecole analizzate. In particolare è stata incentrata l’attenzione sull’andamento del cosiddetto early enrcichment, ovvero sul numero di attivi restituiti nelle prime posizioni. Non tutti gli screening LB effettuati hanno fornito dei buoni risultati, con early enrichment decisamente peggiori rispetto a quelli relativi ai due screening RB, che danno invece una performance soddisfacente. Pertanto, quest’ultima strategia si è dimostrata la migliore nell’ottimizzare il ritrovamento delle molecole attive sulla FAAH all’interno del database di prova. Inoltre, essa ha il vantaggio di poter identificare ligandi che legano porzioni diverse dello stesso sito recettoriale, favorendo la scoperta di nuove classi di inibitori.
I risultati ottenuti da questa fase del lavoro hanno guidato la ricerca di nuovi inibitori della FAAH filtrando il database commerciale Enamine, contenente 938727 molecole, arricchito con i 6 composti attivi precedentemente utilizzati. Dal confronto con il grafico ottenuto per il database di prova, si nota come la performance dello screening RB rimanga pressoché la stessa: ben 5 attivi su 6 (l’83,3%) vengono riconosciuti entro
82 l’ 11,86% del database analizzato, contro il 10,9% del database di prova. Sulla base di questo filtro, il numero di molecole in esame è stato ridotto a 111235.
Come ulteriore strumento per proseguire la ricerca di nuovi inibitori non covalenti dell’enzima FAAH è stato eseguito uno studio di consensus docking. Con questa procedura ogni molecola viene processata da più programmi di docking, fornendo per ognuna di esse varie pose all’interno del sito di legame. Sono stati utilizzati i seguenti software: GOLD, con le sue quattro funzioni di scoring (asp, plp, chemscore, goldscore), Glide, nelle modalità SP e XP, AutoDock, Vina, DOCK e FRED.
Dati gli elevati tempi macchina richiesti dall’utilizzo di un numero cosi elevato di programmi, ci siamo trovati di fronte alla necessità di selezionare un subset di composti notevolmente più piccolo sul quale effettuare lo studio: sono state considerate le 2248 molecole con score migliore a quello del primo ligando attivo riconosciuto durante il virtual screening di FLAP.
Le dieci pose ottenute per ogni ligando (una per metodo) sono state ordinate sulla base della reciproca distanza tra una pose e l’altra, utilizzando un software realizzato appositamente. Studi effettuati nei nostri laboratori hanno dimostrato come più una pose è predetta da diversi metodi più tale pose si avvicina a quella reale, cosi che un approccio di tipo consensus può essere utilizzato come indice di accuratezza di una pose derivante da studi di docking. Per questo motivo sono stati portati avanti nello studio soltanto quei composti la cui pose è stata predetta da un numero elevato di metodi. In particolare, sono state considerate come sufficientemente promettenti le molecole che hanno ottenuto il consenso di almeno 6 metodi su 10. Le molecole che soddisfano questo requisito sono 64 e rappresentano solo il 2,8% di quelle sottoposte alla procedura di consensus docking.
Nell’ultima fase di ricerca è stato realizzato uno studio di dinamica molecolare grazie al software AMBER, in cui viene fornita energia e dunque libertà di movimento ai complessi proteina-ligando. Ciò permette di valutarne la stabilità e di prevedere se il ligando ha mantenuto o meno le interazioni chiave con il sito catalitico della proteina. Se queste non sono sufficientemente forti, il complesso potrà andare incontro a dissociazione.
83 Prima di effettuare l'analisi sui complessi FAAH-ligando calcolati dal docking, la procedura è stata accuratamente calibrata sul complesso di riferimento contenente un inibitore non covalente, dimostrando come il composto mantenga per tutta la durata della dinamica un’ottima stabilità all’interno del sito attivo. Da quest’analisi sono risultati sufficientemente stabili ben 55 complessi.
Per la selezione dei composti più promettenti sono stati seguiti due criteri principali: considerare solo quei composti con un basso numero di gradi di libertà. Gli inibitori non covalenti della FAAH utilizzati negli studi di virtual screening effettuati con FLAP presentano infatti un ridotto numero di torsionali;
considerare solo quei composti con una pose di legame abbastanza simile a quella del ligando cristallografico.
In questo modo, sono stati selezionati 23 composti potenzialmente attivi come nuovi inibitori non covalenti della FAAH, che verranno acquistati e sottoposti a saggi enzimatici per valutarne l’effettiva attività sull’enzima.
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