VALIDAZIONE DELLE PROCEDURE DI SCREENING RIVOLTE ALLA

COVALENTI DELL’ENZIMA FAAH

La validazione di un virtual screening prende in considerazione un database costituito da un set di molecole saggiate e risultate attive nei confronti del target selezionato, e da un grande numero di composti che si presume siano inattivi (chiamati decoys, letteralmente “esche”). Nel nostro caso è stato creato un nuovo database (chiamato FAAH-MUV) contente il set di composti attivi sulla h/FAAH precedentemente

a _{b c}

65 selezionato e i decoys appartenenti al database MUV [vedi paragrafo 2.2.2]. I differenti approcci di virtual screening del programma FLAP sono stati quindi valutati sulla base della loro abilità nel separare le molecole attive dai decoys, attraverso l’analisi degli enrichment plot ottenuti dai corrispondenti risultati. Questi grafici mettono in relazione il numero degli attivi ritrovati (ranked actives, RA) con il numero totale delle molecole analizzate (ranked database, RD). In particolare è stata incentrata l’attenzione sull’andamento del cosiddetto early enrcichment, ovvero sul numero di attivi restituiti nelle prime posizioni. Dopo aver applicato la miglior procedura di screening ad un database commerciale, dovremo selezionare solo la percentuale di composti con i più alti valori di score, pertanto questa è una regione critica da esaminare.

3.3.1 LBVS relativi al database FAAH-MUV

L’intero database di 43629 molecole è stato filtrato utilizzando come templato ognuno dei 6 composti attivi per la FAAH inseriti. Sono stati dunque effettuati 6 LBVS (denominati rispettivamente con il nome della molecola templato), mantenendo inalterati i parametri impostati tra uno screening e l’altro [vedi paragrafo 2.2.3]. Le strutture dei 6 composti attivi sono caratterizzate da scaffold differenti, se si escludono quelle dei ligandi cristallografici 3QK5 e 3QJ9. Questo è un dato importante, in quanto gli enrichment plot relativi non saranno influenzati dalla presenza di eventuali molecole a struttura quasi identica. E’ stato ritenuto opportuno invece inserire entrambe le molecole 3QK5 e 3QJ9, sia per il fatto di poter utilizzare la loro conformazione bioattiva, sia per le dimensioni già ridotte del set di composti attivi utilizzati. Si riportano i dati (Tab.1) e gli enrichment plot relativi agli screening effettuati (Fig.16- 21), espressi attraverso i valori di AUC (area sotto la curva) e la percentuale di database analizzato nella quale vengono restituiti almeno l’80% dei composti attivi (RD_80).

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Screening Scoringf. AUC RD_80

1_45 DRY 0,909 20,1% 1_8 DRY 0,876 26,4% 2_16j DRY 0,881 20,2% 3_158 N1 0,871 21,3% 5_68 H-DRY-H 0,818 16,4% 6_101 N1-DRY 0,729 42,4%

Tab.1 Risultati dei LBVS effettuati

Fig.16 Enrichment plot dello screening 1_8 Fig.17 Enrichment plot dello screening 1_45

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Fig.20 Enrichment plot dello screening 5_68 Fig.21 Enrichment plot dello screening 6_101

3.3.2 RBVS relativi al database FAAH-MUV

La struttura proteica utilizzata come riferimento per i calcoli receptor-based è quella appartenente al complesso cristallografico 3OJ8. Sono stati eseguiti 2 screening, variando soltanto la modalità di identificazione del sito attivo:

3OJ8 (in cui il sito catalitico è definito in base al volume escluso del recettore); 3OJ8_lig ( in cui il sito catalitico è definito in base alla posizione del ligando 3QK5 complessato).

I parametri sono stati lasciati nelle impostazioni di default, ad eccezione del valore di max minima point, che è stato impostato su 100 [vedi paragrafo 2.2.5]. Sono riportati i dati (Tab.2) e gli enrichment plot relativi ai calcoli effettuati (Fig.22-23).

Screening Scoringf. AUC RD_80

3OJ8 Glob-sum 0,862 10,9%

3OJ8_lig Glob-sum 0,873 8,9%

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Fig.22 Enrichment plot del VS 3OJ8 Fig.23 Enrichment plot del VS 3OJ8_lig

Pur non essendo un programma di docking, FLAP esegue un vero e proprio allineamento delle molecole test all’interno del sito recettoriale, classificandole sulla base della sovrapposizione tra i campi di interazione centrati sui loro atomi pesanti (pseudo-MIFs) e i MIFs della proteina [vedi paragrafo 2.1.4]. Abbiamo deciso di verificare, sfruttando la funzione Analyze by molecule, la conformazione restituita da FLAP per le molecole cristallografiche 3QK5 (Fig.24) e 3QJ9 nel virtual screening 3OJ8, considerando la funzione Glob-Sum e abilitando l’opzione “Minimize repulsion”. La pose cristallografica è stata visualizzata come riferimento.

Fig.24 In “licorice” è riportata la pose cristallografica, in “wireframe” la pose restituita da FLAP per il

ligando 3QK5. Sono evidenziati i MIFs della tasca recettoriale, calcolati dai probe H (in celeste), DRY (in verde), N1 (in blu) e O (in rosso).

69 Come possiamo vedere le due conformazioni sono pressoché allineate e ciò indica come FLAP sia in grado, pur eseguendo dei calcoli molto meno raffinati rispetto ad un programma di docking, di posizionare con criterio le molecole all’interno della tasca recettoriale, a conferma della validità di questa procedura di screening preliminare. Le altre molecole attive sono state visualizzate nello stesso modo, ed è stato verificato come l’allineamento consideri l’assenza di repulsioni steriche di una certa rilevanza tra ligando e recettore.

3.3.3 Conclusioni sulla procedure di screening relative al database di

calibrazione FAAH-MUV

Non tutti i LBVS forniscono dei buoni risultati (in particolare lo screening 6_101), con valori di RD_80 molto inferiori rispetto a quelli relativi ai RBVS. Il calcolo che garantisce un early enrichment migliore è il 5_68, con l’80% dei composti attivi ritrovati entro il 16,44% del database analizzato. Le scoring function (SF) che danno i migliori risultati (eccetto per il VS 3_158) sono quelle caratterizzate dal probe DRY, da solo o in combinazione ad altri probe, in accordo con la natura principalmente idrofobica del sito catalitico della FAAH.

Tutti e due i RBVS effettuati danno dei risultati soddisfacenti, lievemente migliori definendo il sito recettoriale in base alla posizione del ligando cristallografico. In questo caso però, le sue dimensioni appaiono inferiori rispetto a quelle calcolate in base al volume escluso del recettore, che si avvicinano di più a quelle reali. In entrambi i casi il composto 5_68 viene restituito oltre il 50% del database analizzato e ciò va a discapito dei valori di AUC. Come già detto, i valori di RD_80 sono nettamente migliori rispetto a quelli relativi ai LBVS proposti. Per quanto riguarda la scoring function Glob-sum, essa considera il contributo dato da ogni SF individuale, e pertanto è caratterizzata da una maggiore accuratezza rispetto a quest’ultime.

Nonostante l’approccio RB utilizzi come templato un’entità vasta come quella di un sito recettoriale, che teoricamente avrebbe potuto dare dei risultati inferiori rispetto ai calcoli LB, gli screening di validazione hanno dimostrato come questa strategia sia la migliore nel riconoscere le molecole attive sulla FAAH all’interno del database di prova. Inoltre,

70 essa ha il vantaggio di poter identificare ligandi che legano porzioni diverse dello stesso sito, favorendo la scoperta di nuove classi di inibitori.

L’approccio di tipo pharmacophore-based non è stato preso in considerazione in questo lavoro di tesi. Il set di attivi, costituito da 6 elementi, avrebbe consentito la creazione di uno o più modelli, ma non avrebbe permesso di valutare la performance dello screening a causa della mancanza di ulteriori composti attivi da sottoporre alla procedura.