microscopia elettronica e attività enzimatica
4.7 Confronto miRNA-155 e IFN in plasma, esosomi e linfocit
Dall’analisi statistica si evidenzia una correlazione degli analiti legati all’infiammazione, come Rec1TNFalfa, Rec1TNFalfa, TNFalfa, TGFβ1, IL6, con la disabilità dei pazienti. Poiché il miRNA-155 è uno dei principali miRNA indotto dai processi infiammatori (O’Connell et al., 2010; Migita et al., 2017),abbiamo confrontato i livelli di miRNA-155 in plasma ed esosomi di pazienti SLA. Inoltre, poiché il miRNA-155 va ad inibire SOCS 1, che è un regolatore negativo della risposta interferonica (Wang et al., 2010), abbiamo misurato anche i livelli di IFNβ. I dosaggi di IFNβ nel sangue possono risultare problematici, abbiamo misurato anche quelli della proteina Myxovirus resistance A (AMX), che è stato dimostrato correlare a IFNβ (Serana et al., 2014).
Plasma Esosomi
Figura 4.8. Confronto miRNA-155 in plasma ed esosomi di pazienti SLA. Vengono riportate in figura le sqRT-PCR di ogni paziente e i risultati sono rappresentati nell’istogramma come
media+SEM.
I livelli di miRNA-155 risultano significativamente più elevati negli esosomi dei pazienti rispetto al plasma. Anche IFN risulta aumentato negli esosomi (Figura 4.8).
79 Inoltre, poiché anche i linfociti sono un indice dell’infiammazione, ed inoltre
costituiscono un potente modello facilmente raggiungibile per studiare le modulazioni cellulari durante le malattie neurodegenerative (Hermann et al., 2013; Wojsiat et al., 2015), siamo andati a confrontare i livelli del miRNA-155 e IFN in linfociti di pazienti e controlli.
Figura 4.9. Confronto miRNA-155 e IFN in linfociti di pazienti SLA e controlli. Livelli di espressione di miRNA-155, IFN e AMX di ogni paziente. I risultati sono rappresentati nell’istogramma
come media+SEM.
I risultati mostrano dei livelli più alti del miRNA-155 in linfociti di pazienti SLA rispetto ai controlli. Mentre, contrariamente a quanto ci aspettavamo, in alcuni casi osserviamo una relazione inversa con i livelli di IFNβ.
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Figura 4.10. Confronto miRNA-155 in linfociti, plasma ed esosomi di pazienti SLA. I risultati sono rappresentati nell’istogramma come media+SEM.
In esosomi e linfociti troviamo un livello più alto del miRNA-155 rispetto ai livelli nel plasma (Figura 4.10).
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5. Discussione
In questa tesi abbiamo cercato di caratterizzare nuovi marcatori molecolari della SLA, una patologia neurodegenerativa piuttosto complessa sia dal punto di vista clinico, con una vasta eterogeneità e aspecificità dei sintomi correlati ad un diverso tasso di progressione della malattia, sia dal punto di vista molecolare. Infatti, ancora non sono conosciuti i meccanismi responsabili della malattia e che possono influire sulla sua progressione. Studi recenti sempre più suggeriscono che la regolazione post- trascrizionale e i meccanismi epigenetici, come i miRNA, sono coinvolti dell'insorgenza e della progressione dei disturbi neurodegenerativi; pertanto, l'espressione alterata del miRNA può causare la deregolazione dei geni chiave e delle vie biologiche che contribuiscono allo sviluppo della SLA (Figueroa-Romero et al., 2016).Come validazione del nostro modello sperimentale abbiamo innanzi tutto valutato l’espressione di due dei principali miRNA già proposti come biomarcatori nella SLA, il
miRNA-29, coinvolto nella sopravvivenza di cellule neuronali (Roshan et al., 2014) e il miRNA-206, la cui deregolazione è coinvolta in molti disturbi muscolari scheletrici (Di
Pietro et al., 2017), verificando che sono overespressi, anche se in modo diverso in relazione allo stadio della malattia nei nostri pazienti.
Dato che sempre più studi dimostrano il coinvolgimento degli esosomi e dei miRNA esosomiali nei processi neurodegenerativi (Fei Tian et al., 2017), abbiamo messo a punto una metodica di estrazione degli esosomi più rapida ed efficiente rispetto alle metodiche di ultracentrifugazione normalmente usate. Allo scopo di stabilire quanto la patologia possa essere rappresentata dagli esosomi circolanti nel sangue che provengono da tutti i comparti corporei, abbiamo caratterizzato i campioni estratti sia come morfologia che come contenuti molecolari. Abbiamo riscontrato sia la presenza di miRNA specifici sia
dell’attività SOD rispetto ai controlli (Grad et al 2013).
È stato dimostrato che le cellule rilasciano gli esosomi in modo costitutivo, ma aumentano il loro rilascio in risposta a una varietà di condizioni patologiche, inclusa la SLA, probabilmente contribuendo alla diffusione della malattia e alla sua progressione (Amyotrophic Lateral Sclerosis and Frontotemporal Degeneration, 2017). Abbiamo testato, quindi, la possibilità di utilizzare gli esosomi circolanti come fonte di
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biomarcatori per la SLA. Siamo andati ad isolare esosomi dal plasma di pazienti affetti da SLA, pazienti affetti da Parkinson e di controlli sani, ed abbiamo visualizzato mediante microscopio elettronico differenze di dimensioni. Per questo scopo abbiamo utilizzato due diverse tecniche e messo in evidenza la superiorità funzionale della separazione
degli esosomi mediante la tecnica di cromatografia SEC.
Abbiamo, inoltre, testato la presenza di attività dell’enzima Cu/Zn SOD1 negli esosomi: una forma mutante di SOD1, infatti, risulta essere trasportata legata alla membrana esosomiale (Grad et al., 2013). L’attività della SOD si è dimostrata essere presente negli esosomi di pazienti SLA ma non nei controlli e nei pazienti PD. Ciò costituisce un’ulteriore
conferma che gli esosomi portano informazioni sulla patologia. Quindi, abbiamo confrontato I livelli di espressione di miRNA-29 e miRNA-206 circolanti
con i livelli di miRNA esosomiali. Come ci aspettavamo, non risultano sostanziali differenze nei loro livelli nei controlli, mentre abbiamo riscontrato alcune differenze nei livelli di questi miRNA nei pazienti affetti da SLA. In particolare, abbiamo riscontrato un aumento dei livelli di miRNA-29 negli esosomi rispetto al plasma dei pazienti. Sembrerebbe, quindi, che miRNA-29 sia maggiormente trasportato dagli esosomi, rilasciati da diversi tipi cellulari, mentre miRNA-206 risulta più elevato nel plasma. Si conferma che il miRNA-206 è un marcatore espresso anche negli esosomi dei pazienti SLA e ritorna a valori normali nella forma a decorso lento. Poiché la neurodegenerazione è definita come una progressiva perdita di struttura o funzione dei neuroni, inclusa la loro morte, la patogenesi della malattia potrebbe derivare da una comunicazione disfunzionale tra tipi di cellule interconnessi per esempio tra neuroni o tra neuroni e cellule gliali (Tasleem Jan et al., 2017). Dal momento che gli esosomi modulano la trasmissione da cellula a cellula di proteine e RNA e quindi svolgono un ruolo nella comunicazione intercellulare, il loro ruolo nella neurodegenerazione è sotto indagine attiva. Si ritiene, infatti, che gli esosomi siano coinvolti nella diffusione di proteine
"tossiche" nei disturbi neurodegenerativi. (Janas et al., 2016).
Basandosi su un data-base che abbiamo costruito con tutti i dati relativi ai pazienti, siamo andati ad analizzare la variazione dei valori del sangue (analisi di routine) citochine e fattori di crescita, molecole di adesione cellulare e selectine in relazione alla progressione della malattia. L’analisi è stata eseguita diacronicamente in 35 pazienti con SLA clinicamente definita e in 30 pazienti affetti da malattia del motoneurone inferiore
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MND2. In particolare, risultano significativi per entrambi l’eritropoietina, correlata a insufficienza respiratoria; TNFα, citochina proinfiammatoria con proprietà regolatrici del ciclo cellulare, e i suoi recettori solubili Rec1TNFα e Rec1TNFα; IL5, che stimola cellule B a produrre IgA; MIP1β, citochina infiammatoria prodotta da macrofagi, cellule dendritiche e linfociti; PDGF, fattore di crescita derivato dalle piastrine; CD3, co-recettore delle cellule T necessario per la loro maturazione; selectina E, espressa sulle cellule
endoteliali in seguito a loro attivazione da parte di citochine. TGFb1, modulato dal miRNA-155 tramite SMAD2 (Louafi et al., 2010), risulta elevato
significativamente nel gruppo MND3, dove il miRNA-155 è più basso rispetto a MND2 indicando che possa essere indicativo del tipo di motoneurone coinvolto. In MND3 risultano essere significativamente correlate all’ALS-FRS anche alcune citochine proinfiammatorie come IL2, IL3, IL4, IL6 e IL12, che quindi possono essere cconsiderate
dei biomarcatori degli stadi più avanzati della malattia.
A partire da queste considerazioni, siamo andati a confrontare i livelli di espressione del
miRNA-155 nel plasma, negli esosomi e nei linfociti di pazienti e controlli. Poiché è dimostrato che nelle malattie neurodegenerative i cambiamenti molecolari si osservano non solo nei neuroni dei pazienti ma anche nelle cellule periferiche, come i linfociti, ed includono cambiamenti nel livello dei marcatori di stress ossidativo, deterioramento dei
mitocondri e regolazione aberrante del ciclo cellulare nei linfociti (Wojsiat et al., 2015).
Il miRNA-155 risulta maggiormente espresso nei linfociti rispetto al plasma, ma maggiormente negli esosomi rispetto ai linfociti. Essendo SOCS1 (suppressor of cithokine signaling 1) uno dei maggiori target di miRNA-155 ed un regolatore canonico negativo di segnalazione IFN, una sovraregolazione di miRNA-155 va a promuovere la risposta immunitaria tramite l’espressione di IFN (Wang et al., 2010): infatti confrontando i livelli di miRNA-155 e IFNβ nei linfociti di pazienti SLA risulta un elevato livello di espressione di entrambi. La diversa espressione di miRNA-155 in plasma, esosomi e linfociti ci fa
ipotizzare un suo ruolo specifico ed a un suo utilizzo come biomarcatore. Gli eventi infiammatori possono, quindi, modulare la patogenesi e la fisiopatologia della
SLA: tuttavia, la sua impronta immunologica a livello sistemico potrebbe non essere facilmente distinguibile, nonostante la forte associazione segnalata di SLA con comorbilità autoimmuni.
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6. Conclusioni
Essendo la SLA una malattia neurodegenerativa molto complessa e spesso con esito infausto, dal momento che ad oggi non risulta esistere ancora una terapia in grado di arrestarne l’avanzamento, sarebbe interessante riuscire ad individuare dei potenziali biomarcatori utilizzabili come target per eventuali farmaci o come marcatori precoci della malattia.
Concentrandoci sull’aspetto fondamentale della patologia, cioè l’infiammazione, abbiamo riscontrato un aumento di miRNA-155 in esosomi e linfociti rispetto al plasma dei pazienti. In particolare, miRNA-155 che risulta andare a modulare alcuni degli analiti che dalla nostra analisi statistica sono correlati significativamente all’ALS-FRS dei pazienti, e risulta presente attività di Cu/Zn SOD1, marker di danno ossidativo, sugli exosomi dei pazienti SLA, ma non nei controlli o nei pazienti Parkinson, indicando che potrebbe essere specifico per la patologia. Pertanto, ulteriori studi in questa direzione potrebbero alla definizione degli exosomi come biomarcatori di SLA e dei linfociti come modello per la malattia.
Inoltre, il nostro studio, unendo l’indagine statistica su tutti i parametri clinici specifici con quella molecolare, intende fornire un modello di analisi integratata altamente predittivo.
La ricerca in questo campo è ancora agli inizi, ma gli exosomi, i miRNA e i linfociti hanno un enorme potenziale diagnostico come biomarcatori non invasivi e strumenti terapeutici delle malattie dei motoneuroni e l’incremento di studi aiuterà sicuramente a convalidare il loro uso come biomarker.
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