CONFRONTO TRA SONDE FLUORESCENTI

Nell’ultima parte della mia tesi ho condotto una valutazione preliminare di due nuove sonde fluorescenti, il Cal-590 ed il Cal-630 che operano rispettivamente nelle regioni spettrali del giallo e del rosso.

Prove iniziali di caricamento utilizzando lo stesso protocollo sviluppato per il Fluo- 4, non hanno dato luogo allo sviluppo di fluorescenza in risposta all’illuminazione. Abbiamo quindi provato ad allungare il tempo di caricamento sino a 30 minuti ed inoltre ad utilizzare temperature di 32°C invece di 22°C. In nessun caso abbiamo potuto notare lo sviluppo di fluorescenza. Abbiamo quindi deciso di provare ad

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utilizzare tempi di caricamento superiori a 60 minuti a 37°C. Tuttavia tali tempi e temperature sono incompatibili con la vitalità delle cellule dissociate in acuto. Per ovviare questo problema abbiamo allora utilizzato delle sezioni di retina dello spessore di 200 µm, generate mediate un micrometro. Dopo 3 ore di incubazione a 37°C abbiamo potuto notare lo sviluppo di fluorescenza sia per il Cal-590 (Figura 28) che il Cal 630 (Figura 29), un’osservazione che indica come queste sonde siano meno permeabili del Fluo-4 e/o presentino dei substrati meno efficienti per le esterasi cellulari.

Figura 28 e Figura 29: nella figura 28 e 29 sono riportati rispettivamente a

sinistra fluorescenza e relativo decadimento con Cal-590 a destra con Cal-630.

Tuttavia, tale fluorescenza appare estremamente sensibile all’esposizione alla luce, con un rapido decremento nell’arco di soli 3 minuti.

Questi risultati preliminari indicano che tali sonde possono essere utilizzate solo in cellule in coltura e che il protocollo di caricamento ed utilizzo dovrà tenere conto della loro elevata fotosensibilità.

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CAPITOLO 5

DISCUSSIONE

In questa tesi sperimentale è stata sviluppata una metodica dell’imaging del Ca2+ nei bastoncelli retinici. In particolare nel nostro studio abbiamo analizzato l’omeostasi del calcio nei bastoncelli adulti sia di topi normali (wt), che di topi portatori di una mutazione non senso del gene Cacna2d4. Abbiamo condotto tale studio sia utilizzando una sonda fluorescente ben nota in letteratura, il Fluo-4, sia conducendo una valutazione iniziale delle proprietà di sonde del Ca2+ di nuova generazione capaci di operare nell’ambito spettrale del rosso quali Cal-590 e Cal- 630.

I risultati ottenuti indicano che canali ionici non selettivi, diversi dai canali voltaggio-dipendenti Cav, contribuiscono all’omeostasi del calcio a livello del corpo

cellulare dei bastoncelli retinici, la regione a livello del quale si trova il nucleo. Le principali evidenze a supporto della presenza di tali canali sono:

1) La variazione del rapporto tra i segnali fluorescenti indotto dall’applicazione di due diverse concentrazioni di KCl, che indica una variazione del potenziale di membrana di queste cellule;

2) La dipendenza dal calcio esterno dai tempi di decadimento dei valori di fluorescenza dopo stimolazione con KCl, un dato coerente con un aumentato influsso attraverso canali della membrana plasmatica distinti dai Cav.

3) L’aumento dei livelli di fluorescenza dopo stimolazione dei Cav tramite KCl è rimosso se [Ca2+]i è ridotto sotto 100 nM dall’applicazione di soluzioni con [Ca2+]ex circa 1 nM.

4) L’attivazione dei canali indipendenti dal voltaggio si verifica anche in cellule nelle quali i depositi intracellulari di Ca2+ sono depleti e sembra innescata dall’apertura dei canali CaV piuttosto che dal rilascio di Ca2+ dai

depositi

Questi risultati sono quindi coerenti con l’idea che all’omeostasi del Ca2+ a livello della regione nucleare dei bastoncelli retinici partecipino oltre che i canali Cav, i sistemi di estrusione e i depositi intracellulari, anche dei canali non selettivi della

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membrana. Questi canali vengono attivati quando [Ca2+_{] supera 200-500 nM e}

vengono deattivati da livelli minori di 100-50 nM.

Infine, la valutazione preliminare di due nuove sonde fluorescenti, il Cal-590 ed il Cal-630 che operano rispettivamente nelle regioni spettrali del giallo e del rosso indicano la loro inadeguatezza per l’utilizzo di cellule acutamente dissociate. La dimostrazione che queste sonde richiedano tempi di caricamento maggiori di 1 ora costituisce la base di partenza per future sperimentazioni rivolte allo studio dell’omeostasi del calcio in cellule in coltura identificabili tramite l’espressione della EGFP sotto il controllo di specifici fattori di trascrizione. Appare di particolare rilevanza l’osservazione che tali sonde non danno luogo a marcature di tipo puntiforme, come si verificava invece con le sonde convenzionali operanti nella regione spettrale del giallo e del rosso, quali le rodamine.

Inoltre, la quantificazione del photobleaching, con un rapido decremento nell’arco di soli 3 minuti per entrambe le sonde, rappresenta un importante punto di partenza per futuri esperimenti che richiederanno l’utilizzo di nuovi protocolli di stimolazione per la valutazione dell’omeostasi del calcio tramite queste nuove sonde.

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CAPITOLO 6.

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