Una volta definito un protocollo di caricamento ed acquisizione dei segnali che permettesse di valutare la risposta a più applicazioni di KCl, abbiamo valutato l’effetto dell’applicazione di soluzioni saline contenenti KCl 16 mM, una concentrazione in grado di indurre una depolarizzazione intermedia rispetto al KCl 25 mM e comunque in grado di attivare una frazione dei canali del calcio voltaggio dipendenti (CaV). Per meglio valutare l’attivazione dei canali CaV, abbiamo esteso
l’analisi a topi affetti da una mutazione spontanea del gene Cacna2d4, che codifica per la proteina accessoria a2d4 del complesso del canale CaV. Nel caso del mutante
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una riduzione dell’ampiezza delle correnti ed uno spostamento della curva di attivazione a potenziali più positivi. Ci si attende quindi che il rapporto tra risposte indotte dall’applicazione del KCl 16 mM e quelle indotte dal KCl 25 mM sia ridotto nei topi mutanti rispetto ai topi wt per il gene Cacna2d4.
I risultati sperimentali illustrati nella Figura 19 mostrano che, come atteso dai dati di elettrofisiologia, sia i topi wt che i mutanti rispondono sia al KCl 16 che al 25 mM. Tuttavia, in contrasto con l’ipotesi iniziale il rapporto relativo tra le risposte al KCl 16 ed il KCl 25 mM non sembrano diverse tra bastoncelli dei topi wt e mutanti.
Figura 19: nei pannelli di sinistra sono riportati i valori di fluorescenza relativi in
funzione del tempo dopo applicazione di soluzione KCl 25 mM prima e KCl 16 mM dopo, in wild type sopra e mutanti sotto. Il pannello di sinistra riporta il rapporto relativo tra le risposte al KCl 16 e il KCl 25 mM in bastoncelli di topi wt
e mutanti.
Allo scopo di comprendere questo risultato inatteso, abbiamo analizzato il decadimento della fluorescenza successivamente all’applicazione del KCl 25 mM. Nel caso in cui il decadimento della fluorescenza sia unicamente dettato dalla cinetica di estrusione del calcio tramite sistemi di trasporto ci si aspetta che la cinetica sia ben interpolata da una singola funzione di decadimento esponenziale, con il ritorno ai valori precedenti la stimolazione. Inoltre ci si attende che le costanti di tempo del decadimento mostrino una contenuta variabilità. Anche in questo caso l’analisi sperimentale ha prodotto risultati non coerenti con l’ipotesi iniziale.
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Come illustrato in Figura 20 per due bastoncelli rappresentativi, sia nel wt che nel mutante il decadimento della fluorescenza è approssimato da una funzione monoesponenziale con costante di tempo (τDECAY) di 12 e 11 s, rispettivamente.
Figura 20: mostra pannello A e B la curva di decadimento della fluorescenza nel
tempo in due bastoncelli rappresentativi, rispettivamente wt e mutante. nel pannello C, è riportata la distribuzione dei valori della costante di tempo di decadimento (τDECAY)in wt e mut Le linee orizzontali continue rappresentano i
valori medi dei due gruppi e le linee tratteggiate riportano i valori relativi ±1 SD rispetto alla media.
Tuttavia, l’interpolazione non è ottimale ed inoltre, dopo oltre 10 costanti di tempo, la fluorescenza non ritorna al valore precedente alla stimolazione. Infine, nel pannello C, si può notare che la distribuzione dei valori di τDECAY mostri una elevata
variabilità sia nei bastoncelli wt che nei mutanti (range 5-40 s).
Questi risultati potrebbero indicare il contributo alla [Ca2+] di canali ionici distinti
dai CaV ma dotati di permeabilità per il calcio, che oltre ad innalzare i livelli di
calcio determinano anche un aumento di τDECAY.
Per valutare questa possibilità abbiamo considerato che l’attivazione di canali cationici dovrebbe comportare una depolarizzazione capace di alterare l’attivazione dei Cav, e come tale rilevabile dalla variazione del rapporto tra le risposte a soluzioni contenenti KCl 16 mM rispetto a quelle contenenti KCl 25 mM.
(C) (A)
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Abbiamo quindi utilizzato un protocollo nel quale le cellule venivano esposte in successione a soluzioni contenenti KCl 25, KCl 16, KCl 25, KCl 16.
Figura 21: i pannelli di destra e sinistra rappresentano la fluorescenza relativa in
funzione del tempo dopo esposizione in successione a soluzioni saline di KCl 25, KCl 16, KCl 25, KCl 16 mM in due bastoncelli isolati da wt.
Come illustrato in Figura 21 per due bastoncelli isolati da topi wt, il rapporto tra le ampiezze delle risposte al KCl 16 e quelle al KCl 25 mM aumentano nel corso della registrazione, un risultato compatibile con la variazione dell’attivazione dei canali CaV in risposta alla depolarizzazione legata all’attivazione di canali non voltaggio
dipendenti.
I valori delle variazioni % delle risposte al KCl 25 (A) e al KCl 16 mM (B) sia nei topi wt che mutanti sono riportati in figura 22.
Tale variazioni sono significativamente diverse tra wt e mutanti nel caso delle risposte al KCl 16 mM (P=0.0062, test esatto di Fisher), ma non nel caso delle risposte al KCl 25 mM, come atteso nel caso di variazioni della curva di attivazione dei canali CaV.
Nel pannello C, le variazioni % della risposta al KCl 16 mM sono riportate in funzione della variazione % delle risposte al KCl 25 mM. La linea tratteggiata è quella attesa in caso di perfetta correlazione (pendenza 1) tra le variazioni % alle 2 concentrazioni di KCl. Si può notare che nel caso dei wt (simboli vuoti) 4 cellule su 9 deviano in maniera significativa dalla linea di correlazione, mentre nel caso dei bastoncelli mutanti la dispersione attorno a tale curva è più contenuta.
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Figura 22: il pannello di sinistra indica i valori delle variazioni % delle risposte al
KCl 25 (A) e al KCl 16 mM (B) sia nei topi wt che mutanti. Nel pannello C, si hanno le variazioni % della risposta al KCl 16 mM, riportate in funzione della variazione % delle risposte al KCl 25 mM. La linea tratteggiata è quella attesa in caso di perfetta correlazione (pendenza 1) tra le variazioni % alle 2 concentrazioni
di KCl. wt (simboli vuoti)
La Figura 23, illustra invece le variazioni spontanee di fluorescenza (frecce rivolte verso il basso) che si osservano in alcune bastoncelli, in particolare in quelli isolati da topi wt in seguito alla stimolazione con KCl 25 e 16 mM.
Figura 23: nel pannello sopra è riportata la fluorescenza relativa in funzione del
tempo in risposta a applicazione di soluzione KCl 25, 16, 25 mM, in cellula isolata da wt. Le frecce gialle indicano delle variazioni spontanee della
fluorescenza
Queste variazioni spontanee potrebbero sia rappresentare delle attivazioni spontanee di canali non selettivi distinti dai CaV, ma anche a degli eventi legati al
rilascio spontaneo di Ca2+ dai depositi intracellulari, come illustrato nella Figura 2. (A)
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