4.5 Cooling vibrazionale
Il cooling vibrazionale è il fenomeno per cui il picco di assorbimento di una certa specie elet- tronica si sposta in lunghezza d'onda durante la misura, a causa di eetti di rareddamento del campione nel tempo. Infatti, la fotoeccitazione all'origine delle transizioni elettroniche ri- sulta in specie eccitate con energia vibrazionale in eccesso localizzata in una o più vibrazioni attive di Franck-Condon [10].
Un prerequisito all'uso del global t è che i dati consistano in una combinazione lineare di componenti indipendenti dal tempo. Questo non è vero se il cooling vibrazionale porta a un cambiamento nel tempo della frequenza vibrazionale [8]. Questo fenomeno ha un'importanza non trascurabile nelle cinetiche da noi presentate.
Possiamo monitorare lo spostamento dei picchi dello spettro totale di assorbimento tran- siente in funzione del tempo, al ne di studiare il processo di cooling vibrazionale. Ri- cordiamo che questi picchi non rappresentano quelli di una data specie elettronica, ma dell'assorbimento transiente globale.
Per studiare la posizione dei picchi in funzione del tempo una possibilità è eseguire un t sui dati con una combinazione lineare di due gaussiane, con una funzione del tipo
f (t) = a1· e− (x−b1) c1 2 + a2· e− (x−b2) c2 2
dove b1 e b2 sono in buon accordo con la posizione reale dei picchi dello spettro di as-
sorbimento transiente. Questo è uno strumento per studiarne la posizione in funzione del tempo e per riprodurne la forma funzionale, anche se a priori quest'ultima non è gaussiana. Tuttavia l'andamento - sia nella proteina legata sia in quella non legata - è riprodotto in ottima approssimazione da questa forma funzionale, come mostrato in gura (4.24), nella quale riportiamo un esempio per quel che riguarda lo spettro di assorbimento transiente della proteina legata a t = 1.63 ps.
400 410 420 430 440 450 460 470 −1 −0.8 −0.6 −0.4 −0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 Lunghezza d’onda (nm) ∆Α
Figura 4.23: Spettro di assorbimento transiente in funzione della lunghezza d'onda a t = 1.63 ps. Il t è riportato in gura: ∆A = −1.1 · e−
(x−423nm) 2,9nm2
2
+ 0.63 · e−(x−438)3.9nm2 2
4.5 Cooling vibrazionale 4 ANALISI DATI
4.5.1 Spostamento dei picchi dello spettro di assorbimento transiente della proteina non legata
In questa sezione presentiamo i dati relativi alla dinamica di cooling vibrazionale - nel caso della proteina non legata - in corrispondenza sia della scomparsa della specie non legata sia della comparsa dello stato elettronico eccitato Mb∗
II.
Il minimo dell'assorbimento transiente, in prossimità dunque della mioglobina non legata è ben rappresentato, no a ∼ 7 ps, da un singolo esponenziale, come mostrato in gura (4.25).
0 1 2 3 4 5 6 7 420 422 424 426 428 430 432 434 436 Tempo (ps) Lunghezza d’onda (nm)
Figura 4.24: Posizione del picco dell'assorbimento transiente in prossimità della scomparsa della mioglobina deoxy in funzione del tempo. f(t) = (15 · e−x/2.2ps+ 421) nm
Il risultato per il tempo caratteristico è τD= 2.2 ps.
Il cooling corrisponde a ∼ 14 nm, ed è dunque importante, e non trascurabile nei nostri dati in quanto il suo tempo caratteristico è confrontabile con quelli delle specie elettroniche in gioco.
Inoltre, anche il massimo dell'assorbimento transiente, in prossimità della specie elet- tronica Mb∗
II, è soggetto ad un andamento dello stesso tipo, il che conferma che Mb∗II
corrisponde ad uno stato eccitato vibrazionalmente caldo. In gura (4.26) riportiamo il t a singolo esponenziale eettuato sulla posizione di questo picco, che presenta un tempo caratteristico τDII = 1.8 ps. 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 446 446.5 447 447.5 448 448.5 449 Tempo (ps) Lunghezza d’onda (nm)
Figura 4.25: Posizione del picco dell'assorbimento transiente attorno a 450 nm (in prossimità della comparsa della specie Mb∗
4.5 Cooling vibrazionale 4 ANALISI DATI
4.5.2 Spostamento dei picchi dello spettro di assorbimento transiente della proteina legata
In questa sezione presentiamo e discutiamo gli analoghi risulati per lo spettro di assorbimento della proteina legata, in prossimità del picco della specie non legata che viene formata, in termini di una presenza non nulla della specie elettronica eccitata Mb∗
II.
Il massimo dello spettro di assorbimento transiente presenta un andamento crescente e decrescente in funzione del tempo e abbiamo così eseguito il t come somma di due espo- nenziali, mostrando il risultato in gura (4.27). Questo andamento può essere spiegato con una prima rapida fase di riscaldamento della mioglobina deoxy, seguito da un più lento coo- ling. La salita iniziale, con tempo caratteristico di 1.8 ps, può essere interpretata inoltre, in virtù di questa sua durata nel tempo, come una distorsione del transiente dovuta alla specie M b∗II che assorbe attorno a 462 nm, a testimoniare della non completa assenza di questo processo. Nonostante ciò, la cinetica di questa specie - prodotta in quantità trascurabile nella mioglobina legata con il CO - è totalmente nascosta dallo spettro transiente totale in corrispondenza del suo picco di assorbimento.
0 5 10 15 20 25 30 437.2 437.4 437.6 437.8 438 438.2 438.4 438.6 Tempo (ps) Lunghezza d’onda (nm)
Figura 4.26: Posizione del picco dell'assorbimento transiente attorno a 435 nm (in prossimità della comparsa della mioglobina deoxy) in funzione del tempo. f(t) = (−12 · e−x/2.2ps+ 11 ·
e−x/2.6ps+ 438) nm
Il risultato per i tempi caratteristici è τCO1= 2.2 pse τCO2= 2.6 ps.
Il cooling corrisponde a ∼ 0.4 nm. Come si nota il picco si stabilizza attorno a una frequenza di ∼ 438 nm.
5 CONCLUSIONE
5 Conclusione
In questa dissertazione ci siamo occupati di indagare nel dettaglio la cinetica ultraveloce della mioglobina in seguito alla fotolisi realizzata tramite la pompa attinica a 547 nm, in corrispondenza delle bande Q. Questa cinetica è ultraveloce e fondamentale per comprendere la dinamica dell'eme dell'emoproteina negli istanti immediatamente successivi alla fotolisi. La tecnica che ci ha permesso di trarre informazioni è la spettroscopia pump and probe, in particolare l'assorbimento transiente. Lo studio della cinetica e la stima del numero di specie coinvolte nella reazione è di notevole di coltà, in quanto i picchi di assorbimento delle specie elettroniche sono vicini in lunghezza d'onda, e la sovrapposizione delle rispettive code tende a mascherare le cinetiche. Si può dunque ricorrere a tecniche di t avanzate che prendono in considerazione l'intero spettro di assorbimento.
L'analisi da noi condotta conferma le ipotesi fatte in letteratura, in particolare quella di un decadimento sequenziale degli stati eccitati verso lo stato fondamentale. Tramite un modello per la cinetica dei tre stati rappresentanti la proteina non legata e le due specie eccitate Mb∗
I e Mb ∗
II, abbiamo potuto guidare e interpretare l'analisi su tutte le lunghez-
ze d'onda dello spettro di assorbimento transiente. Nonostante questo, l'eetto di cooling vibrazionale è un'ulteriore complicazione all'interpretazione dei dati, e non è stato preso in considerazione nell'analisi globale. I risultati sono comunque positivi in quanto conferma- no la predominanza di due processi, da noi interpretati come apparizione delle due specie elettroniche eccitate delle eme non legato, Mb∗
I e Mb∗II.
Abbiamo studiato inoltre la dinamica del cooling vibrazionale, confermando l'ipotesi di lavorare con stati vibrazionali dell'eme caldi, sia per quel che riguarda lo stato fondamentale sia per gli stati eccitati.
RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI
Riferimenti bibliogra ci
[1] Camilla Ferrante, Dipartimento di Scienze Chimiche - Università degli studi di Padova, Pump and Probe
[2] Pagina di Wikipedia sulla Mioglobina
[3] Marten H. Vos, Ultrafast dynamics of ligands within heme proteins, Biochimica et Biophysica Acta 1777, 1531 (2008)
[4] Michela Badioli, Generazione di impulsi tunabili al picosecondo per spettroscopia Raman risolta in tempo, Tesi di Laurea Magistrale
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[6] Stefan Franzen, Laurent Kiger, Claude Poyart, and Jean-Louis Martin, Heme Photo- lysis Occurs by Ultrafast Excited State Metal-to-Ring Charge Transfer, Biophysical Journal 80, 23722385 (2005)
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, 990-996 (2008)[8] Luuk J. G. W. van Wilderen, Craig N. Lincoln, Jasper J. van Thor, Modelling Multi- Pulse Population Dynamics from Ultrafast Spectroscopy, PLoS ONE 6(3): e17373, doi:10.1371/journal.pone.0017373, (2011)
[9] Karsten Neumann et al., Primary Reaction Dynamics of Green Absorbing Proteo- rhodopsin WT and D97N Mutant Observed by fs Infrared and Visible SPectroscopy, Ultrafast Phenomena XVI: Proceedings of the 16th International Conference (2009) [10] Jun Qian, Sandra L. Schultz, John M. Jean, Observation of intramolecular vibratio-
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