Global t

Un global t è un potente strumento che permette l'estrazione delle informazioni in- dipendenti dal tempo (come la forma degli spettri che rappresentano una transizione in un esperimento di spettroscopia) presenti nei dati. Questo approccio semplica di molto l'interpretazione delle dinamiche osservate riducendo la dimensionalità del problema, cioè descrivendo i dati tramite spettri indipendenti dal tempo.

La procedura di t del pacchetto Ultrafast Toolbox usa due metodi dierenti, la ricerca basata sul gradiente e quella diretta, per analizzare i dati (dipendenti dal tempo) X(t) [8]. Queste procedure di t sono basate sul calcolo e la minimizzazione della somma dei residui:

minX(X(t) − X(t))2 (4.1)

dove X(t) è la matrice di dati aspettata. Un metodo ampiamente impiegato per minimizzare una funzione di questo tipo è l'analisi dei minimi quadrati non lineare. A questo scopo si usa un metodo basato sul gradiente dove la dierenziabilità della funzione è essenziale dal momento che la derivata prima della funzione di errore (4.1) dev'essere calcolata (iterativa- mente). Se il problema è multidimensionale (come nel nostro caso, il problema si pone su varie lunghezze d'onda), bisogna cercare il minimo assoluto su di una supercie. Il problema dei metodi basati sul gradiente è che un gradiente alto in un punto può portare a minimiz- zare la funzione su di un minimo locale. Una possibile soluzione è usare dierenti valori di partenza (random), anche se in teoria se ne dovrebbero usare un numero innito.

Un metodo di ricerca diretto può essere più potente nella denizione di un minimo assoluto, poiché ha una tendenza più bassa a restare in un minimo locale. In questo caso si costruisce una griglia attorno ad un punto di partenza sulla supercie in questione (su cui non c'è richiesta di dierenziabilità né di continuità) e conseguentemente tutte le direzioni sono iterativamente scansionate. Se l'algoritmo incontra un valore più basso (ricordiamo che stiamo parlando della somma dei residui denita nell'equazione precedente), il nuovo valore diventa il nuovo punto di partenza, e l'algoritmo riparte, ma con una griglia più grande. La dimensione della griglia diminuisce se tutti i punti scansionati hanno un valore più alto di quello del punto di partenza. Questo tipo di algoritmo è detto patternsearch ed è particolarmente eciente nell'ottimizzazione di problemi ad alta dimensionalità.

Nella spettroscopia ultraveloce, come mostrato nel paragrafo 1.2, si usano andamenti esponenziali per descrivere processi come i segnali di assorbimento transiente:

X(t) = y0+ n

X

i=1

4.4 Analisi globale 4 ANALISI DATI

Dove y0 rappresenta la baseline (che può essere dovuta, per esempio, a una ricombina-

zione geminata), Ai le ampiezze - indipendenti dal tempo - e τi le costanti di tempo per

ognuno degli n esponenziali che determinano la concentrazione o la popolazione degli stati. In un esperimento di assorbimento transiente gli Airappresentano gli spettri corrispondenti

ai processi che avvengono nella matrice dei dati (sono dunque una funzione di λ) e i τi i loro

rispettivi tempi caratteristici.

Nel caso di decadimenti multi-esponenziali, bisogna fornire al programma un modello di connessione tra gli stati su cui eseguire il global t dei dati, che può essere creato tramite un'interfaccia graca intuitiva sul pacchetto Matlab SimBiology ed esportato in formato xml utilizzabile da Ultrafast Toolbox. In questo modo possiamo inserire il modello che abbiamo proposto nella sezione 4.2. L'approccio usato da SimBiology è quello di risolvere il problema numericamente, cioè di risolvere il sistema di equazioni dierenziali ordinarie per le concentrazioni dipendenti dal tempo di ogni componente. La somma delle concentrazioni di tutte le componenti allo stesso istante di tempo è normalizzata a 1.

L'obbiettivo dell'analisi globale è quello di estrarre dai dati gli spettri indipendenti dal tempo Ai(λ)e le costanti di tempo τi, denite dal modello. Le costanti di tempo sono comuni

indipendentemente a tutte le lunghe d'onda misurate, mentre le ampiezze a loro associate possono variare su ogni lunghezza d'onda. Il metodo di lavoro di Ultrafast Toolbox è quello di generare prima i proli di concentrazione (dipendenti dal modello, nel nostro caso quello dell'ipotesi sequenziale descritta nella sezione 4.2) ed eettuando un t di questi ultimi sui dati, estrarre gli spettri e le costanti di tempo [8].

Riportiamo nelle gure (4.19) e (4.20) i risultati del global t eettuato sull'intero spettro di assorbimento transiente della mioglobina non legata.

4.4 Analisi globale 4 ANALISI DATI

Figura 4.18: Figura in alto: Dati caricati dello spettro di assorbimento della mioglobina deoxy (griglia nera) e global t sui dati (a colori). In basso: proli di concentrazione in funzione del tempo per le tre specie elettroniche, risultato del t sui dati. In verde f0,

corrispondente alla proteina non legata, in rosso f2, corrispondente a Mb∗II, e in blu f1,

corrispondente a Mb∗

I. Gli andamenti sono in accordo con quelli ipotizzati nel modello

sequenziale. 420 430 440 450 460 470 480 490 −0.15 −0.1 −0.05 0 0.05 Lunghezza d’onda (nm) ∆Α

Figura 4.19: Spettri indipendenti dal tempo per le tre specie elettroniche. I risultati estratti dal global t per i tempi caratteristici sono

4.4 Analisi globale 4 ANALISI DATI

rispettivamente associati agli spettri in blu, rosso e verde. Le tre linee orizzontali stanno a indicare la posizione dei picchi di assorbimento delle tre specie coinvolte nella reazione, nell'ordine la proteina non legata (435 nm), Mb∗

I (448 nm) e Mb∗II (462 nm).

Possiamo interpretare come un processo di scomparsa della mioglobina deoxy e compar- sa dello stato eccitato Mb∗

I lo spettro associato al tempo corto (in blu) e come scomparsa

della mioglobina deoxy e comparsa dello stato eccitato Mb∗

II lo spettro associato al tempo

lungo (in rosso). Ci aspettiamo, come mostrato precedentemente, la presenza di soli due tempi caratteristici del sistema, anche se il modello necessita di tre frequenze di transizione. Lo spettro in verde dovrebbe dunque apparire piatto per rispettare il nostro modello. La distorsione di questo spettro rispetto al valore nullo costante può essere interpretato tramite la presenza del fenomeno di cooling vibrazionale, un fenomeno di spostamento dei picchi di assorbimento nel tempo che discuteremo nella sezione 4.5. L'intepretazione di uno degli spettri caratteristici risultanti dal global t in termini di un processo di rilassamento vibra- zionale è stata data anche in altri studi [9]. Abbiamo così spiegato la presenza del terzo processo non trascurabile che appariva nell'SVD.

Possiamo in seguito eseguire un confronto tra gli andamenti attesi - calcolati in base al modello presentato nella sezione 4.2, inserendovi le frequenze di transizione stimate nella sezione 4.3 - e gli andamenti predetti da quest'ultimo sulle tre lunghezze d'onda corrispon- denti ai picchi di assorbimento degli stati elettronici coinvolti, calcolati secondo la formula (4.1). Riportiamo in blu gli andamenti ottenuti dal modello e in azzurro quelli ricavati dal global t. 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 Tempo (ps) ∆Α

Figura 4.20: Confronto tra gli andamenti risultanti dal modello sequenziale e dal global t in funzione del tempo a λ = 435 nm, in corrispondenza del picco di assorbimento della proteina non legata

4.4 Analisi globale 4 ANALISI DATI 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 −0.4 −0.3 −0.2 −0.1 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 Tempo (ps) ∆Α

Figura 4.21: Confronto tra gli andamenti risultanti dal modello sequenziale e dal global t in funzione del tempo a λ = 448 nm, in corrispondenza del picco di assorbimento di Mb∗

II 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 Tempo (ps) ∆Α

Figura 4.22: Confronto tra gli andamenti risultanti dal modello sequenziale e dal global t in funzione del tempo a λ = 460 nm, in corrispondenza del picco di assorbimento di Mb∗

I

Come si può vedere, i tempi sono sovrastimati, ma gli andamenti sono rispettati. Inter- pretiamo questa sovrastima in termini della presenza del cooling vibrazionale.