Facoltà di Scienze Matematiche Fisiche e Naturali
Corso di Laurea in Fisica
Assorbimento transiente in
mioglobina fotolizzata
Relatore:
Dott. Tullio Scopigno
Dissertazione di Laurea Triennale di:
Fabrizio Pittorino
Indice
1 Introduzione 2
1.1 Lo schema pump e probe . . . 2
1.2 La teoria dell'assorbimento transiente . . . 2
1.3 Generalità sulla mioglobina . . . 5
2 Foto sica della mioglobina 8 2.1 L'ipotesi parallela . . . 8
2.2 L'ipotesi sequenziale . . . 10
3 Apparato sperimentale 12 3.1 Schema e caratteristiche . . . 12
3.2 Preparazione del campione . . . 13
3.3 Metodologia raccolta dati . . . 14
4 Analisi dati 16 4.1 Presentazione dei dati di assorbimento transiente . . . 16
4.2 Un possibile modello per l'ipotesi sequenziale . . . 20
4.3 Cinetica sui picchi di assorbimento delle specie transienti . . . 21
4.3.1 La proteina non legata . . . 23
4.3.2 La proteina legata con il monossido di carbonio (CO) . . . 26
4.4 Analisi globale . . . 30
4.4.1 Singular Value Decomposition (SVD) . . . 30
4.4.2 Global t . . . 32
4.5 Cooling vibrazionale . . . 37
4.5.1 Spostamento dei picchi dello spettro di assorbimento transiente della proteina non legata . . . 38
4.5.2 Spostamento dei picchi dello spettro di assorbimento transiente della proteina legata . . . 39
1 INTRODUZIONE
1 Introduzione
1.1 Lo schema pump e probe
Sviluppare tecniche in grado di indagare la materia su scale temporali estremamente brevi è stato uno degli obbiettivi della spettroscopia ottica negli ultimi anni. Lo sviluppo di laser che emettono impulsi al femtosecondo ha reso possibile studiare processi chimici e biologici che avvengono su scale temporali inferiori al picosecondo. Per indagare questi fenomeni ultraveloci si utilizza la tecnica di misura pump-probe. In questa tecnica, un impulso corto (un valore tipico è ∼ 50fs) nel visibile, la cui funzione è la fotodissociazione o una qualche trasformazione del campione, è combinato con un secondo impulso che in linea di principio -non perturba il sistema ed è utile allo studio delle proprietà di interesse, come l'assorbimento visibile o infrarosso, in funzione del ritardo temporale - regolabile - tra i due impulsi. Si ottengono così informazioni sul processo innescato dal pump con una risoluzione temporale limitata principalmente dalla durata degli impulsi (rimane la di coltà tecnica di generare impulsi laser ultrabrevi nel MIR e nel FIR).
Gli esperimenti di pump and probe permettono di ottenere informazioni sulla dinamica di rilassamento degli stati eccitati e sulle proprietà di assorbimento degli stessi. E' di particolare interesse, in un campo di studi interdisciplinare che unisce sica, chimica e biologia, lo studio delle modi cazioni di strutture molecolari durante reazioni (ultra)veloci. Le informazioni si possono inferire attraverso queste tecniche di spettroscopia ottica in cui l'assorbimento gioca un ruolo importante data la sensibilità ai cambiamenti strutturali. Tecniche più avanzate, che permettono di indagare scale temporali ancora più brevi, fanno uso della spettroscopia Raman e non verranno trattate in questa dissertazione.
1.2 La teoria dell'assorbimento transiente
L'esperimento è realizzato focalizzando un fascio di pump e un fascio di probe sul campione, misurando l'intensità del segnale di probe in presenza del pump (Ip(τ )) e in sua assenza
(Ip(−∞)), in funzione del ritardo temporale tra questi ultimi.
∆Ip(τ ) =
IP(τ ) − IP(−∞)
Ip(−∞)
Per descrivere le osservabili siche misurate sperimentalmente consideriamo un esempio semplice:
Consideriamo un sistema descritto da un sistema a due livelli: stato fondamentale (g) e stato eccitato (e). Lo stato eccitato può essere un qualunque livello elettronico, vibrazionale o vibronico del sistema [1].
Si utilizzano, per il momento, pump e probe monocromatici di stessa frequenza. In assenza del pump tutte le molecole si trovano nello stato fondamentale g, e vale:
dIp(−∞)
1.2 La teoria dell'assorbimento transiente 1 INTRODUZIONE
da cui
Ip(−∞) = Ip0exp(−N σeg(ωp)d)
Dove N è il numero di molecole per unità di volume, d è il cammino ottico dell'impulso di probe nel campione e σeg(ωp)è il coe ciente di assorbimento per la transizione g → e,
che dipende dalla frequenza del probe ωp.
Quando si applica il pump, si genera un popolazione non nulla nello stato eccitato e l'intensità del probe dipenderà da quante molecole sono rimaste nello stato fondamentale e sono quindi ancora in grado di assorbire, e da quelle che assorbono nello stato eccitato. L'intensità del probe sarà maggiore, in questo caso particolare, rispetto a quella che si ha in assenza del pump. All'aumentare del ritardo τ il numero di molecole che si trovano nello stato eccitato diminuisce - decadono verso lo stato fondamentale - e di conseguenza varierà anche l'intensità del probe.
dIp(τ )
dz = −ng(τ )σeg(ωp)Ip(−∞) = [−N + ne(τ )]σeg(ωp)Ip(−∞) N = ng(τ ) + ne(τ )
Ip(τ ) = Ip0exp(−N σeg(ωp)d + ne(τ )σeg(ωp)d)
Sostituendo le espressioni ottenute per Ip(τ )e Ip(−∞)in ∆Ip(τ ):
∆Ip(τ ) =
Ip(τ ) − Ip(−∞)
Ip(−∞)
= exp(ne(τ )σeg(ωp)d) − 1
Se abbiamo ∆Ip(τ ) 1, espandendo in serie di Taylor al primo ordine:
∆Ip(τ ) ≈ ne(τ )σeg(ωp)d
Dunque dallo spettro di assorbimento transiente possiamo studiare la dinamica di rilas-samento della popolazione generata dal pump nello stato eccitato e.
Per descrivere l'evoluzione temporale si utilizza spesso un modello fenomenologico che assegna ad ogni stato eccitato un tempo di vita medio cui contribuiscono tutti i processi, radiativi e non, attraverso cui può avvenire la diseccitazione da tale stato verso lo stato fondamentale.
Nel caso del sistema a due livelli, le molecole che si trovano nello stato eccitato e possono decadere solo verso lo stato g. Se attribuiamo a tale stato un tempo di vita medio τe allora
l'evoluzione della popolazione nello stato e viene descritta dalla seguente reazione cinetica: dne(t) dt = + σeg(ωL)IL(t) ~ωL (N − ne(t)) − σeg(ωL)IL(t) ~ωL ne(t) − ne(t) τe
Dove i termini a secondo membro descrivono rispettivamente l'assorbimento, l'emissione stimolata e l'emissione spontanea.
1.2 La teoria dell'assorbimento transiente 1 INTRODUZIONE
Se la popolazione generata nello stato eccitato è piccola rispetto a quella totale (in accordo con l'approssimazione precedentemente fatta) allora:
dne(t) dt ≈ + σeg(ωL)IL(t) ~ωL N −ne(t) τe
Risolvendo l'equazione dierenziale si ha:
ne(t) = ˆ t −∞ dt0exp[t − t 0 τe ]N σeg(ωL)IL(t 0 ) ~ωL
Se la durata dell'impulso è breve rispetto al tempo di vita τe, si può descrivere l'impulso
come una delta di Dirac IL(t 0 ) = FLδ(t0) FL= ˆ ∞ −∞ I(t)dt ne(t − t0) = θ(t − t0)exp[− t − t0 τe ]N σeg(ωL)FL ~ωL E poiché t − t0 = τ e ne(0) = N σeg(ωL)FL
~ωL , la popolazione generata dal pump nello
stato e al tempo τ è:
ne(τ ) = ne(0)exp[−
τ τe
]
La popolazione presenta un decadimento esponenziale nel tempo, la cui costante di deca-dimento è il tempo di vita τe. Quest'ultimo può essere visualizzato misurando la variazione
d'intensità del probe in presenza e assenza del pump. ∆Ip(τ ) = (ne(0)σeg(ωp)d)exp[−
τ τe
]
Solitamente si usa la dierenza di assorbanza, de nita come il logaritmo dell'intensità. Ricordando l'ipotesi fatta, ∆Ip 1, segue ∆Ip(τ ) =IP(τ )−IIp(−∞)P(−∞) = IpIP(−∞)(τ ) − 1.
Da questo IP(τ ) Ip(−∞) = ∆Ip(τ ) + 1 = (ne(0)σeg(ωp)d)exp[− τ τe ] + 1 e dunque ∆A = ln( IP(τ ) Ip(−∞) ) = ln((ne(0)σeg(ωp)d)exp[− τ τe ] + 1) ≈ (ne(0)σeg(ωp)d)exp[− τ τe ] al primo ordine nello sviluppo di Taylor.
Variando ωp è possibile sondare l'eetto del cambio di popolazione (cioè la cinetica) sia
nello stato fondamentale sia nello stato eccitato.
Quando si misura ∆A(τ, ωp)si ottiene una matrice di dati che può essere visualizzata in
1.3 Generalità sulla mioglobina 1 INTRODUZIONE
Figura 1.1: ∆A in funzione della frequenza ωp per un determinato tempo τ : Spettro di
assorbimento transiente
Figura 1.2: ∆A in funzione del tempo τ per determinati valori di frequenza ωp : Curve di
decadimento o crescita
Fino ad ora il sistema è stato descritto con un semplice schema di due livelli. In genere, nei sistemi molecolari, il numero di livelli da considerare per descrivere il rilassamento della popolazione inizialmente creata dal pump è superiore a due.
L'evoluzione temporale viene descritta in questo caso non da una singola equazione dif-ferenziale cinetica, ma da una serie di queste, che descrivono l'evoluzione temporale di tutte le popolazioni che si formano nei livelli elettronici presenti nel sistema a seguito dell'ecci-tazione iniziale. Se la serie di equazioni dierenziali è abbastanza semplice si può risolvere analiticamente, altrimenti bisogna ricorrere alla simulazione numerica.
1.3 Generalità sulla mioglobina
La mioglobina è una proteina globulare appartenente al gruppo delle emoproteine (pro-teine contenti l'eme) la cui funzione è quella di legare reversibilmente l'ossigeno [2]. La sua funzione siologica è quella di trasportatore intracellulare di ossigeno nelle brocellule mu-scolari. La sua struttura è simile a quella dell'emoglobina ma ha un'a nità per l'ossigeno sei volte superiore. La mioglobina è costituita da una singola catena polipeptidica avvolta su sé stessa, da ciò deriva il fatto che è capace di legare una sola molecola di ossigeno per volta. La singola catena peptidica della mioglobina contiene l'eme. L'eme è un complesso chimico composto da un atomo di ferro coordinato con i 4 atomi di azoto di una por rina (da
1.3 Generalità sulla mioglobina 1 INTRODUZIONE
πoρφυρα, , porpora). L'eme conferisce la colorazione rossa ai muscoli in quanto la dierenza di energia tra due orbitali molecolari è nel range del visibile, tra 500 e 600 nanometri, e la radiazione attorno a 690 nm, cioè nel rosso, non viene assorbita. Il Fe può formare due legami, uno su ciascuna delle due facce del piano dell'eme e che formano il V e VI sito di coordinazione. Nella mioglobina il V sito di coordinazione è occupato da un'istidina (un amminoacido). Il VI sito di coordinazione può essere occupato da un ligando esterno, in particolare l'ossigeno molecolare O2, il monossido di carbonio CO o il monossido di
azo-to NO. Nella deossimioglobina (mioglobina deoxy), il sesazo-to siazo-to di coordinazione è vuoazo-to e perciò è disponibile per il legame con l'ossigeno.
La gura (1.3) mostra la struttura generale dell'eme. L'eccitazione ottica dell'eme 6-coordinato porta, come vedremo in dettaglio, a popolazioni di stati eccitati di vita intrin-secamente corta. Questi hanno carattere anti-legante e possono portare alla dissociazione del legame Fe-ligando in qualche decina di femtosecondi. La dissociazione porta l'eme ad assumere una struttura a cupola in 1ps [3].
Figura 1.3: Struttura generale dell'eme (A) e del legame del Fe con i ligandi (la quinta posizione è occupata dall'istidina) (B). A destra, rappresentazione 3d dell'eme (in rosso) legato con CO (in verde) e istidina (in blu) all'interno della matrice dell'emoproteina.
Figura 1.4: Rappresentazione dell'eme non legato (a sinistra) e legato con il CO (a destra). Si noti la diversa posizione rispetto al piano delle eme dell'atomo di ferro (in giallo). Nella proteina non legata, infatti, l'atomo di ferro, a causa del legame con l'istidina, si trova leggermente sotto il piano dell'eme (conformazione domed, a cupola), mentre nella proteina legata, il legame con il monossido di carbonio (CO) compensa questo eetto.
1.3 Generalità sulla mioglobina 1 INTRODUZIONE
I processi funzionali in molte emoproteine coinvolgono il legame con i ligandi e il rilascio o lo scambio di ligandi interni o esterni. La dissociazione siologica del legame Fe-ligando avviene tramite attivazione termica; la propagazione di cambiamenti funzionali può avvenire in competizione con la riformazione del legame dell'eme con il ligando. La probabilità di questo evento dipende dal ligando e in particolare è determinata dalla struttura e dalla dinamica della proteina.
La rottura termica dei legami eme-ligando, o l'arrivo di ligandi esterni nella matrice della proteina, non possono essere sincronizzati sulla scala temporale del sub-picosecondo. I metodi sperimentali si basano sul fatto che il legame Fe-ligando può essere dissociato, con alto rendimento, usando fotoni in risonanza con le transizioni elettroniche dell'eme. La fotodissociazione non è un evento siologico, ma può essere usato per riprodurre la disso-ciazione termica funzionale e la dissodisso-ciazione dei ligandi che non sono siologici (è il caso del CO nella mioglobina), le dinamiche dei quali sono usate per studiare il comportamento dell'eme. Si usano dunque tecniche di assorbimento pump-probe, in cui un impulso corto (tipicamente ∼50 fs) nel visibile provoca la fotodissociazione, ed è combinato con un secon-do impulso elettromagnetico che serve a studiare proprietà quali l'assorbimento, visibile o infrarosso [3]. A questo scopo generalmente si fotolizza la proteina in corrispondenza delle bande di assorbimento elettronico nella regione tra i 500 nm e i 600 nm, dette bande Q, e si studiano i modi vibrazionali associati alla banda di assorbimento Soret, il cui picco si trova tipicamente nel range 350=450 nm. Questi modi danno informazioni sullo stato di coordinazione del ferro e sui legami dei ligandi [4].
Figura 1.5: Spettri di assorbimento per le forme legata (MbCO) e non legata (deoxy) della mioglobina
Studieremo le dinamiche dell'eme, del ligando e della proteina, così come la loro intera-zione, sulla scala temporale del femtosecondo e del picosecondo. Questa scala temporale è rilevante per i cambiamenti strutturali che avvengono nella stretta vicinanza dell'eme. Pro-blemi ancora aperti alla ricerca scienti ca sono il doming dell'eme, cioè i meccanismi di formazione della struttura a cupola dell'eme in seguito alla fotodissociazione, e le cause e le dinamiche dei cambiamenti strutturali indotti dalla diversa coordinazione dell'eme con i ligandi.
2 FOTOFISICA DELLA MIOGLOBINA
2 Foto sica della mioglobina
2.1 L'ipotesi parallela
Una possibile ipotesi sulla cinetica della mioglobina in seguito alla fotodissociazione è stata data da J.L. Martin e si basa su spettri di assorbimento transiente dell'emoglobina e della mioglobina non legate e legate con CO, O2 o NO, studiati al ne di dare una descrizione
della foto sica delle emoproteine che comprenda la loro fotodissociazione, l'origine e il destino degli stati transienti a vita breve osservati, e l'apparizione delle emoproteine non legate nello stato fondamentale [5].
L'interpretazione che segue ai dati sperimentali è l'apparizione simultanea, conseguente alla fotodissociazione del ligando, che ha luogo in meno di 50 fs (risoluzione temporale dell'apparato sperimentale usato), di due specie distinte. Queste due specie sono assegnate a stati eccitati dell'eme non legato, chiamati Hb∗
I e Hb∗II. (I risultati presentati sono relativi
all'emoglobina, ma sono qualitativamente applicabili alle emoproteine con la stessa struttura dell'eme, come appunto la mioglobina).
Hb∗I decade in 300 fs allo stato fondamentale non legato. La popolazione diHb∗II varia con il ligando, ed è più signi cativa quando il ligando è O2o NO piuttosto che quando è CO.
Si suggerisce anche che la fotodissociazione sia totale, a prescindere dalla natura del ligando. La bassa resa fotodissociativa per quel che riguarda i complessi eme-NO ed eme-O2, come
si misura sulla scala del millisecondo, è dunque in questo attribuibile a una veloce (2.5 ps) ricombinazione di O2o NO con Hb∗II.
La dinamica di assorbimento del Soret dell'emoproteina legata può essere descritto da un processo di rilassamento con una costante di tempo di 2.5-3.2 ps e da un processo più lungo, attribuito alla ricombinazione geminata, che va da 10 ps approssimativamente nei componenti eme-NO no ad arrivare alla scala dei nanosecondi nei composti eme-CO. In questo processo di rilassamento è visibile anche una componente a 300 fs, attribuibile all'ap-parizione di un'altra specie che è creata dopo la fotodissociazione del ligando e che ha un assorbimento non trascurabile nella regione della banda di Soret della specie legata: l'eme non legato nello stato fondamentale.
La componente a 2.5-3.2 ps è comune a tutti i composti, legati e non legati. Il suo peso relativo, tuttavia, è sensibile al ligando. In particolare, questa componente comprende il 65-75% del decadimento del transiente nei composti con O2 e NO. Nei composti eme-CO
questa componente è inibita: il suo peso è stimato minore con un rapporto di 1
5 rispetto alla
componente veloce.
L'assorbimento a ∼ 480 nm appare istantaneamente ed è ben descritto da un decadi-mento a singolo esponenziale caratterizzato da una costante di tempo di 300 fs. E' questa specie che assorbe a 480 nm che è attribuita al precursore dello stato fondamentale della specie non legata (Hb∗
I). Analogamente, l'assorbimento a 460 nm appare istantaneamente,
ma il suo decadimento è dominato da un processo caratterizzato da una costante di tempo di 2.5 ps. Questa specie è attribuibile a Hb∗
II.
La presenza dei decadimenti di assorbimento a 300 fs e 2.5-3.2 ps in tutti gli eme-composti investigati, inclusi i composti non legati, è essenziale per l'identi cazione di questi processi come stati eccitati dell'eme non legato.
2.1 L'ipotesi parallela 2 FOTOFISICA DELLA MIOGLOBINA
Riassumendo, l'apparizione istantanea di specie che hanno il massimo dell'assorbimento alla stessa lunghezza d'onda sia nelle proteine legate sia in quelle non legate suggerisce che queste due specie siano stati eccitati dell'eme non legato. Poiché la specie corrispondente all'emoproteina non legata appare con una costante di tempo di 300 fs, Hb∗
I, che decade
con la stessa costante di tempo, è considerato il precursore della specie non legata, mentre il fatto che l'assorbimento della banda di Soret non legata comprenda una componente a 2.5-3.2 ps è interpretabile con il fatto che Hb∗
II sia uno stato eccitato la cui formazione è
competitiva con la fotodissociazione del ligando come misurato sulla scala del microsecondo. E' suggerito che la resa fotodissociativa sia 1 in tutti gli eme-composti e che Hb∗
II abbia
una reattività nei confronti del ligando maggiore di quella di Hb∗
I. Poiché nei composti
eme-CO la popolazione di Hb∗
II è piccola, si osserva un'alta resa fotodissociativa su scale di
tempo maggiori di 10ps dopo la fotodissociazione del ligando. Inversamente, nei composti eme-NO ed eme-O2, in cui la popolazione di Hb∗II è maggiore, la resa fotodissociativa è
considerevolmente più bassa. Un fattore addizionale che contribuisce al valore estremamente basso del fattore di fotodissociazione nei composti eme-NO è la fase rapida (∼ 10 ps) della ricombinazione geminata.
Non c'è ancora accordo nella comunità scienti ca, un possibile schema proposto [5], che può riassumere la foto-cinetica tra i vari stati descritta in precedenza, è mostrato in gura (4.2).
Figura 2.1: Spettri di assorbimento generalizzato delle emoproteine e dei loro fotoprodotti. Le relazioni tra le specie sono illustrate in gura (2.1) e descritte in più dettaglio nel testo. X denota il ligando che può essere O2, CO e NO. Le specie corrispondenti a stati eccitati della
proteina non legata, Hb∗
I e Hb∗II, sono formate in meno di 50 fs dalla fotodissociazione di
HbX, ma la quantità di Hb∗
I e Hb∗II dipende da X. τI è la costante di tempo per la formazione
della specie deoxy da Hb∗
I. τII è la costante di tempo per il decadimento di Hb∗II allo stato
fondamentale. τG è la costante di tempo della ricombinazione geminata e dipende sia dal
ligando sia dall'emoproteina. Il diagramma è applicato al caso speci co dell'emoglobina, ma è applicabile in generale alla dinamica delle emoproteine come modello. Ovviamente la forma e la posizione degli spettri sono invece applicabili esclusivamente all'emoglobina.
2.2 L'ipotesi sequenziale 2 FOTOFISICA DELLA MIOGLOBINA
2.2 L'ipotesi sequenziale
Studi successivi [6, 7] della foto sica dell'eme delle emoproteine, basati sempre su spettri di assorbimento transiente, forniscono una nuova interpretazione. L'ipotesi è un percorso di rilassamento comune a entrambe le forme di Hb∗ (che qui rappresenta l'eme
fotolizza-to), legata e non legata, in cui lo stato eccitato 1Q (cioè lo stato eccitato dell'eme legato
immediatamente precedente alla fotolisi) decade sequenzialmente nello stato fondamentale:
1Q → Hb∗
I → Hb∗II → Hb. L'osservazione delle cinetiche conferma i tempi caratteristici
della vita di questi stati come <50fs, ∼ 300fs, ∼ 3ps per1Q, Hb∗
I, e Hb
∗
II
rispettiva-mente. Questo indica che la formazione di Hb∗
II non è istantanea. In questo modello, la
componente a ∼ 3−4ps sarebbe dovuta all'eme eccitato che può anche essere caldo. Un altro decadimento sequenziale che spiega i dati sperimentali è 1Q → Hb∗
I → Hb, dove Hb è lo
stato fondamentale vibrazionalmente caldo. In questo caso il ritorno allo stato fondamentale dell'eme avviene con una costante di tempo di 300fs, dovuta al decadimento del Hb∗
I.
Lo spettro di assorbimento transiente di Hb∗
I appare sulla stessa scala di tempo della
fotolisi per HbCO e per HbNO, e l'intensità e la frequenza di Hb∗
I nella deoxy è la stessa
di quella osservata nei composti HbCO e HbNO fotolizzati. Anche se con una dierenza in intensità, le somiglianze nell'assorbimento transiente della specie Hb∗
II in HbCO e in Hb
indicano che il decadimento foto sico segue in entrambi i casi lo stesso percorso, e che le specie elettroniche eccitate Hb∗
I e Hb∗II sono le stesse nel caso della proteina legata e non
legata.
L'ipotesi precedente per la quantità di Hb∗
II seguente alla fotolisi era legata
all'osser-vazione di dierenti rendimenti nella fotodissociazione del ligando. Questa ipotesi era ba-sata su di una connessione empirica tra l'intensità nell'assorbimento della specie transiente Hb∗II e l'intensità della fase rapida della cinetica di ricombinazione del ligando. Tuttavia lo stretching-mode del legame Fe-CO non riprende sulla scala di tempo dei ∼ 3ps, evidenziando che su questa scala il CO non si ricombina [6]. Le dierenze nella ricombinazione del ligando per ligandi diversi sono dunque da attribuire ad altre cause.
2.2 L'ipotesi sequenziale 2 FOTOFISICA DELLA MIOGLOBINA
Figura 2.2: Schema cinetico della foto sica dell'eme. La fotoeccitazione allo stato 1Q è
indicata con la linea serpeggiante. La fotolisi avviene sulla scala di tempo del rapido deca-dimento dello stato1Qallo stato Hb∗
I. Il decadimento da Hb ∗
I allo stato fondamentale può
avvenire direttamente (linea tratteggiata) o passando per lo stato Hb∗
II (linea continua).
k10, k12, k20 sono le frequenze relative alle transizioni rappresentate schematicamente in
3 APPARATO SPERIMENTALE
3 Apparato sperimentale
3.1 Schema e caratteristiche
In questo paragrafo descriveremo l'apparato utilizzato per eettuare le misure di assor-bimento transiente ultraveloce.
Figura 3.1: Set-up dell'esperimento di assorbimento transiente
La sorgente utilizzata è un sistema laser costituito da un oscillatore a titanio za ro (Ti:Sa) e un ampli catore rigenerativo che emette impulsi di lunghezza d'onda di ∼ 800nm di larghezza di banda di ∼ 30nm e rate di ripetizione di 1KHz.
L'OPA (Optical Parametric Ampli er) permette la generazione di lunghezze d'onda al di fuori della banda del laser tramite processi non lineari in cristalli, accompagnandolo con un impulso di più bassa frequenza i cui fotoni sono in parte convertiti in fotoni (a più bassa energia) del segnale. Tramite l'OPA si genera la pompa attinica a ∼547nm, utile alla fotolisi. Il fascio in uscita dal laser viene diviso in due fasci al ne di creare il fascio di pump e il fascio di probe. Il fascio a 800 nm viene focalizzato su una nestra di CaF2, in costante
movimento per non permettere al fascio di incidere sempre sulla stessa porzione di cristallo, cosa che lo daneggerebbe. Questo ovviamente richiede, per una misura soddisfacente, una buona omogeneità del cristallo. Attraverso processi di dispersione non lineare si ottiene una luce con impulsi di durata ∼ 40fs e frequenza in una nestra di 400-700 nm.
L'intensità del probe viene misurata in funzione del ritardo temporale tra questo e il pump imposto dalla Delay Line (DL). Per quel che riguarda quest'ultima, 30µm di separazione spaziale tra i due impulsi equivalgono ad un ritardo temporale di 100 fs.
La risoluzione temporale è data dall'autocorrelazionedegli impulsi di pump e probe ed è quindi dell'ordine di ∼ 40fs.
3.2 Preparazione del campione 3 APPARATO SPERIMENTALE
La pompa attinica ha frequenza tale da stimolare il processo fotochimico d'interesse. Generando λpump= 547nm, si è in risonanza con la Q-band il che permette percentuali di
fotolisi del ∼ 10% utilizzando energia di pump Epump= 1µJ. L'impulso ultrabreve di luce
bianca e la pompa attinica vengono sovrapposti spazialmente sul campione.
Per risolvere le frequenze dello spettro di assorbimento transiente si fa uso di un mo-nocromatore. Nello strumento la luce policromatica entra da una fenditura e tramite un sistema ottico viene inviata su un reticolo di dirazione che disperde il fascio scomponen-dolo nelle sue componenti spettrali. Il rivelatore è costituito da una camera CCD (Charged Coupled Device) che permette di misurare tutto lo spettro visibile. La CCD consiste in un circuito integrato formato da una griglia di elementi semiconduttori in grado di accumulare una carica elettrica proporzionale all'intensità della radiazione elettromagnetica che li colpi-sce. Questi elementi sono accoppiati in modo che ognuno di essi, sollecitato da un impulso elettrico, possa trasferire la propria carica ad un altro elemento adiacente. Inviando al di-spositivo una sequenza temporizzata d'impulsi, si ottiene in uscita un segnale elettrico grazie al quale è possibile ricostruire la matrice dei pixel che compongono l'immagine proiettata sulla super cie della CCD stessa.
Il chopper, la cui frequenza di rotazione è stimata attorno ai 500Hz, assicura l'arrivo a intermittenza del fascio di pump sul campione, permettendo la collezione di impulsi di probe temporalmente adiacenti in presenza e in assenza di fotolisi.
3.2 Preparazione del campione
Il campione a nostra disposizione è una soluzione acquosa di mioglobina equina in forma ferrica, previamente centrifugata. La mioglobina ferrica viene ussata con azoto allo stato gassoso per eliminare ogni traccia di ossigeno presente nel campione. La mioglobina è conservata nello stato ferrico, in cui l'atomo di ferro è nel suo stato di ossidazione più alto, F e3+. In questo stato, la mioglobina è legata con una molecola di H
2O presente in
soluzione. A nché il ligando possa legarsi (reversibilmente) alla mioglobina, è necessario che il Fe del gruppo eme si trovi nello stato di ossidazione +2, detto stato ferroso. Si aggiunge quindi in soluzione un agente riducente, il ditionito di sodio (un sale), che serve a passare dalla mioglobina nello stato ferrico alla mioglobina allo stato deoxy, cioè non legata e pronta al legame con il ligando, con numero di ossidazione +2, secondo la reazione di riduzione:
M b − (F e3+− H2O)
N a2S204
−→ M b − F e2+
Ecco spiegata la funzione del usso di azoto: la mioglobina deoxy è fortemente reattiva nei confronti dell'ossigeno, ma non si lega con l'azoto. Grazie al usso di azoto siamo quindi in grado di ottenere una soluzione di mioglobina non legata tramite la riduzione con il ditionito di sodio.
In ne, la mioglobina CO è preparata a partire dalla deoxy, ponendo in una soluzione di quest'ultima un usso di CO allo stato gassoso, secondo la reazione
3.3 Metodologia raccolta dati 3 APPARATO SPERIMENTALE
Una pompa meccanica muove il campione all'interno della cella alla velocità di ∼ 10cm/s per assicurare che la fotolisi realizzata dal pump sia eettuata su di un campione fresco (cioè non fotolizzato) ad ogni presa dati. La pompa a nostra disposizione è una pompa peristaltica, tale che non ci sia interazione diretta tra la pompa e il campione: un disco con delle palette metalliche comprime il tubo nel quale è contenuto il campione, per pomparlo verso la cella su cui incidono i fasci.
L'esperimento è condotto a temperatura ambiente.
3.3 Metodologia raccolta dati
Il fascio di pump passa attraverso un chopper tarato a frequenza di 500Hz, che fa passare il fascio di pump alternato rispetto al probe, per misurare ION, relativo all'intensità del probe
in presenza di pompa attinica, e IOF F, intensità del probe in assesenza di pompa attinica.
A ogni pasaggio del fascio di pump attraverso il chopper viene calcolato il rapporto ION IOF F su
due valori temporalmente adiacenti. E' questo infatti il risultato nale delle nostre misure, dato che vogliamo misurare la dierenza di assorbanza del probe in assenza e in presenza del pump. La quantità di interesse è la dierenza tra le assorbanze in presenza e in assenza di pump: ∆A = AON − AOF F = ln( ION I0 ) − ln(IOF F I0 ) = ln(ION I0 · I0 IOF F ) = ln(ION IOF F ) E' bene notare che non è necessario misurare I0, valore dell'intensità del probe in assenza
della cella.
Ad ogni passo (regolabile) della Delay Line - che corrisponde ad un certo ritardo τ tra fascio di pump e fascio di probe - si acquisisce dunque un numero N - tipicamente dell'ordine di 500 - di valori di ION, IOF F e del loro rapporto ad ogni lunghezza d'onda su un range
che va da ∼ 300nm a ∼ 700nm. I valori di ION
IOF F riportato nei dati sono, ad ogni lunghezza
d'onda e ad ogni tempo, la media dei rapporti ION
IOF F sulle 5000 acquisizioni, piuttosto che il
rapporto delle medie di ION e IOF F eseguite. Nel secondo caso, un valore di ION o IOF F
che si discosti dalla media pesa meno nel valore nale di ION IOF F.
Infatti, assumendo che l'errore di misura sia lo stesso per tutte le acquisizioni:
σ(1 N X ION IOF F ) = 1 N v u u t N X i=1 [ 1 I2 OF Fi σ2 IONi+ ( IONi I2 OF Fi )2σ2 IOF Fi] σ( P ION/N P IOF F/N ) = v u u t N X j=1 [ 1 (PN i=1IOF Fi) 2σ 2 IONj+ ( N X i=1 IONi) 2 1 (PN i=1IOF Fi) 4σ 2 IOF Fj]
Come si può vedere, nella propagazione degli errori nel secondo caso i pesi corrispondono alle medie dei valori su tutti le acquisizioni, mentre nel primo caso sono i valori stessi. Un singolo valore che si discosti dalla media peserà dunque in maniera più incisiva nel primo
3.3 Metodologia raccolta dati 3 APPARATO SPERIMENTALE
metodo di calcolo della dierenza delle assorbanze. Si è scelto quest'ultimo per il seguente motivo: assumendo che le misure non si discostino molto dalla media, è più sensibile a problemi di trigger, cioè alla capacità sperimentale di distinguere tra le misure in presenza del fascio di pump e quelle in sua assenza, in quanto è più sensibile a cambiamenti repentini, che verrebbero ouscati nell'altro modo. Un errore sistematico nelle misure risulta in questo modo più evidente e si può tentare di risolverlo prima di procedere ad altre misure.
I dati per un generico ritardo temporale τ nel caso della mioglobina legata con il monos-sido di carbonio sono mostrati in gura 3.2.
300 350 400 450 500 550 600 650 700 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5x 104 Lunghezza d’onda (nm) Intensità (nJ) 400 420 440 460 480 500 520 540 560 −1 −0.8 −0.6 −0.4 −0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 Lunghezza d’onda (nm) DA
Figura 3.2: A destra in blu ION e in rosso IOF F; a sinistra ln(IIOF FON ). Si nota la pompa
attinica a 547nm. La cinetica invece si svolge tra i ∼ 400nm e i ∼ 500nm, in corrispondenza dei picchi di Soret delle specie elettroniche coinvolte.
In conclusione, possiamo notare che poiché l'apparato è ottimizzato per la spettroscopia Raman, non si può misurare I0, relativo all'intensità del probe in assenza della cella, che
servirebbe da riferimento. Si possono solo misurare i valori dell'intensità in presenza della cella. La possibilità di misurare I0 può essere un possibile miglioramento dell'apparato
4 ANALISI DATI
4 Analisi dati
4.1 Presentazione dei dati di assorbimento transiente
In questa sezione ci occuperemo di illustrare i dati della foto-cinetica della mioglobina presi in assorbimento transiente. Questi ultimi possono essere arrangiati in una matrice che abbia come indice di riga la lunghezza d'onda, come indice di colonna i tempi, e come elementi i valori della dierenza delle assorbanze ∆A. Se ne può fare un gra co tridimensionale in cui questa dierenza è funzione del tempo e della lunghezza d'onda.
Figura 4.1: Assorbimento transiente nel caso della mioglobina deoxy. La scala di colori è relativa a ∆A.
Data l'eccellente qualità della presa dati, si possono inferire informazioni qualitative sulla dinamica studiando visivamente i gra ci, in cui la scala di colori è indice del valore della dierenza delle assorbanze ∆A (con e senza pump) in ogni punto del piano tempo-lunghezze d'onda (la scala di colore è indicata in gura).
A causa del passaggio - prima di arrivare al campione - della radiazione in mezzi con indice di rifrazione dipendente dalla lunghezza d'onda, siamo in grado di vedere, data l'elevata risoluzione temporale con cui lavoriamo, il fenomeno noto come chirp temporale: il tempo di arrivo della radiazione sul campione dipende dalla lunghezze d'onda con una forma funzionale incognita ma a prima vista regolare, che è stata considerata in certi casi parabolica [6].
Si nota la comparsa - istantanea, considerando il chirp - di un picco attorno a 462 nm (comparsa Mb∗
I) e in corrispondenza di questo un'altrettanto istantanea decrescita su 435
nm (scomparsa mioglobina deoxy). Il picco a 462 nm si estingue con un tempo rapido, e dopo di questo si crea un picco intorno a 448 nm (comparsa Mb∗
II), che decade con un tempo
più lungo. In corrispondenza di questi tempi di rilassamento si vede crescere l'assorbimento a 435 nm no a ritornare attorno allo zero in un tempo di qualche picosecondo. Questa analisi gra ca è interessante in quanto fornisce intuitivamente informazioni sui dati: un picco può essere interpretato come una specie che nasce, un avvallamento come una specie che muore in seguito alla fotolisi.
4.1 Presentazione dei dati di assorbimento transiente 4 ANALISI DATI
Tramite una routine scritta in Matlab abbiamo potuto eliminare il chirp: dopo un'accu-rata selezione di alcuni punti corrispondenti all'inizio della cinetica a varie lunghezze d'onda, la routine esegue un t polinomiale (indicato in blu in gura (4.2)) che riproduce l'andamen-to del chirp in funzione della lunghezza d'onda. Ad ognuna di queste viene dunque associal'andamen-to un ritardo di arrivo che viene sottratto alla relativa scala di tempo, de nendone così una dif-ferente ad ogni volta. La routine interpola per ogni lunghezza d'onda i valori della dierenza di assorbanza su una scala di tempo prede nita, al ne di ride nirla in maniera univoca.
Figura 4.2: Ingrandimento sull'inizio della fotocinetica e sul chirp della deoxy. La scala di colori è relativa a ∆A.
In gura 4.3 riportiamo i risultati ottenuti tramite eliminazione del chirp sulla matrice di dati della mioglobina deoxy.
Figura 4.3: Assorbimento transiente della mioglobina deoxy decirpato, no a 15 ps. La scala di colori è relativa a ∆A.
4.1 Presentazione dei dati di assorbimento transiente 4 ANALISI DATI
Un analogo procedimento ci porta al risultato per l'MbCO mostrato in gura (4.4). Si può notare come in questo caso si presenti istantaneamente un solo picco dal tempo di vita breve a 462 nm, corrispondente a Mb∗
I, mentre il fatto che non si noti un picco pronunciato
sui 448 nm indica che il canale di Mb∗
II è inibito, in accordo con le precedenti osservazioni
sperimentali [5]. La traccia rossa a 435 nm corrisponde alla comparsa della miglobina deoxy mentre quella blu a 419 nm alla scomparsa della MbCO, infatti è a queste lunghezze d'onda che c'è il massimo dell'assorbimento del picco Soret delle due specie, rispettivamente non legata e legata. Si nota inoltre che questi andamenti non ritornano allo zero ma a una baseline costante dovuta al fatto che la ricombinazione geminata - de nita nella sezione 4.3 - tra ligando ed eme, susseguente alla fotodissociazione, per il ligando CO si svolge sulla scala di tempo del nanosecondo e può essere considerata congelata nel nostro studio sulla scala del sub-picosecondo [5].
Figura 4.4: Assorbimento transiente della MbCO decirpato, no a 10 ps. La scala di colori è relativa a ∆A.
Nelle gure 4.5 e 4.6 possiamo illustrare meglio la dinamica visualizzando gli spettri di assorbimento transiente a vari tempi caratteristici.
4.1 Presentazione dei dati di assorbimento transiente 4 ANALISI DATI 410 420 430 440 450 460 470 480 490 −0.14 −0.12 −0.1 −0.08 −0.06 −0.04 −0.02 0 0.02 0.04 0.06 Lunghezza d’onda (nm) ∆Α t=0.07ps t=0.6ps t=0.33ps t=1.14ps t=2.5ps t=8.0ps
Figura 4.5: Spettri di assorbimento transiente della mioglobina deoxy a tempi selezionati Possiamo notare l'immediata comparsa di un picco attorno a 460 nm - attribuibile al-l'apparizione istantanea di Mb∗
I - e la sua rapida sparizione, cui segue la comparsa di un
picco a 450 nm, attribuibile a Mb∗
II. Contemporaneamente un avvallamento attorno a 430
nm indica la scomparsa della proteina non legata nello stato fondamentale. In seguito il transiente ritorna verso lo zero, e in questo rilassamento è visibile una distorsione dei picchi di assorbimento, dovuta, come vedremo, all'eetto di cooling vibrazionale, che de niremo nella sezione 4.5 e che porta a una distorsione dei picchi di assorbimento nel tempo.
410 420 430 440 450 460 470 480 490 −1.2 −1 −0.8 −0.6 −0.4 −0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 Lunghezza d’onda (nm) ∆Α t=7ps t=1.3ps t=0.13ps t=0.067ps
Figura 4.6: Spettri di assorbimento transiente della mioglobina legata con il CO a tempi selezionati
4.2 Un possibile modello per l'ipotesi sequenziale 4 ANALISI DATI
comparsa di un picco a 448 nm (il canale di Mb∗
IIè inibito), e con la stabilizzazione dei picchi
relativi alla scomparsa della proteina legata (avvallamento) e alla comparsa della proteina non legata (picco) attorno a un valore costante, che indica la lenta fase della ricombinazione geminata. Possiamo notare la presenza di una distorsione del picco, dovuta al cooling vibrazionale anche in questo caso.
4.2 Un possibile modello per l'ipotesi sequenziale
Ricordando lo schema della foto sica relativo al decadimento sequenziale ipotizzato in gura 2.2, possiamo costruire un possibile modello che ci permetta di interpretare i dati sperimentali.
Assumiamo f0, f1 e f2 i livelli di popolazione e k10, k12, k20 le frequenze di
transi-zione. f0, f1 e f2 rappresentano Mb (stato fondamentale), Mb∗I e Mb∗II (stati eccitati)
rispettivamente.
Il sistema di equazioni dierenziali a cui il sistema risponde, in corrispondenza con lo schema atteso è: Ad ogni tempo, f0+ f1+ f2= 1 e df0 dt + df1 dt + df2 dt = 0 Condizioni iniziali: f0(0) = f2(0) = 0 ; f1(0) = 1
Questo set di equazioni dierenziali è risolvibile analiticamente: Autovalori:
4.3 Cinetica sui picchi di assorbimento delle specie transienti 4 ANALISI DATI Autovettori: 1 0 0 k10−k20 k12 k20−k12−k10 k12 1 −1 0 1 In ne, la soluzione generale è:
f0(t) = 1 + f1(0) k12 k20− k12− k10 [e−k20t+k10− k20 k12 e−(k10+k12)t] f1(t) = f1(0)e−(k10+k12)t f2(t) = f1(0) k12 k20− k12− k10 [−e−k20t+k10− k20 k12 e−(k10+k12)t]
E' utile osservare che, nonostante la presenza di tre frequenze di decadimento, la ci-netica del sistema di tre livelli è descritta da soli due tempi caratteristici: τlento = k120 e
τveloce = k 1
10+k12. Questo è consistente con le nostre osservazioni sperimentali in
assor-bimento transiente, che presentiamo nella sezione 4.3: la Deoxy (435 nm) è popolata con entrambi i tempi. La Mb∗
I si spopola solo con τveloce, mentre la Mb∗II è popolata con τveloce
e si scarica con τlento.
4.3 Cinetica sui picchi di assorbimento delle specie transienti
In questa sezione studieremo il problema della cinetica della mioglobina in seguito alla fotodissociazione eseguendo t a singola lunghezza d'onda sui picchi di assorbimento delle specie transienti.
Per studiare la dinamica di rilassamento degli stati eccitati, conviene eseguire il t delle dinamiche sui picchi di assorbimento di ciascuna specie elettronica coinvolta. Sono infatti presenti nello spettro di assorbimento transiente tutti gli spettri delle specie elettroniche in gioco, e questo pone problemi di interpretabilità dei dati a lunghezze d'onda lontano dai picchi. Infatti su queste lunghezze d'onda è presente una sovrapposizione delle code dei vari spettri di assorbimento. In corrispondenza del picco di assorbimento di ciascuna specie, invece, nonostante il contributo delle code dei picchi corrispondenti alle altre specie elettroniche sia presente, in particolar modo se i picchi sono vicini in lunghezza d'onda, si assume che il contributo dominante all'assorbimento sia quello della specie in questione.
Poichè ci si aspettano due soli tempi caratteristici del sistema, come mostrato nella sezione 4.2, i t sui picchi di assorbimento delle specie elettroniche sono eettuati come somma di due esponenziali, inserendo una baseline per la mioglobina legata con il CO per rappresentare la lenta ricombinazione del CO con la mioglobina - sulla scala del nanosecondo - secondo la formula f(t) = e−t
τ1 + e− t τ2 + c.
La ricombinazione geminata è dovuta al fatto che la fotodissociazione avviene in soluzione acquosa: la mioglobina e il monossido di carbonio collidono con le molecole del solvente
-4.3 Cinetica sui picchi di assorbimento delle specie transienti 4 ANALISI DATI
che limita l'allontanamento dei due fotoframmenti a pochi Angstrom - per poi collidere tra loro e ricombinarsi. In questo caso bisogna quindi introdurre un termine costante nel t (una baseline), il cui valore rappresenta la presenza in soluzione della proteina non legata che si ricombina col CO sulla scala del nanosecondo e la cui popolazione può essere quindi conside-rata costante nel tempo dopo la cinetica ultraveloce degli stati Hb∗
I e Hb∗II. Ovviamente il
t va eettuato escludendo la fotolisi, che avviene secondo in tempi <50 fs [5], per studiare l'eettiva dinamica di rilassamento dei due stati eccitati verso lo stato fondamentale.
Di particolare interesse è la dinamica di assorbimento transiente a λprobe = 435nm,
in corrispondenza del picco di Soret della proteina non legata, riportato integralmente in esempio in gura (4.7). Abbiamo utilizzato come variabile la dierenza delle assorbanze ∆A (il logaritmo dei rapporti delle intensità). A t > 0 (a causa del chirp) una rapida discesa (∼ 50fs) indica la fotolisi, cioè il decadimento dello stato 1Q, conseguente alla
fotoeccitazione, negli stati eccitati dell'eme non legato, con conseguente scomparsa dello stato fondamentale. Gli stati eccitati decadono integralmente su quest'ultimo in una decina di picosecondi, come si può capire dal fatto che, in questo lasso di tempo, la dierenza delle assorbanze in presenza e in assenza del pump torna a zero, indicando la ricomparsa dello stato fondamentale. 0 5 10 15 20 25 −0.14 −0.12 −0.1 −0.08 −0.06 −0.04 −0.02 0 0.02 Tempo (ps) DA
4.3 Cinetica sui picchi di assorbimento delle specie transienti 4 ANALISI DATI
4.3.1 La proteina non legata
Riportiamo i risultati dei t bi-esponenziali a singola lunghezza d'onda sui picchi delle specie transienti nel caso della mioglobina non legata.
0 5 10 15 20 25 −0.14 −0.12 −0.1 −0.08 −0.06 −0.04 −0.02 0 0.02 Tempo (ps) ∆Α
Figura 4.8: Assorbimento in funzione del tempo per λ = 435 nm, in corrispondenza del picco di Soret della mioglobina non legata
I risultati del t con λprobe = 435nm, in gura (4.8), sono in perfetto accordo con i
risultati sperimentali già ottenuti [5, 6], fatta eccezione del tempo lungo: ∆A = ln(Ion(t)
Iof f
) = 0.69 · e−t/0.33ps+ 0.31 · e−t/2.4ps
Il tempo di decadimento di Mb∗
II è da noi stimato sensibilmente più basso di quello
4.3 Cinetica sui picchi di assorbimento delle specie transienti 4 ANALISI DATI 0 5 10 15 20 25 30 −0.01 −0.005 0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0.035 0.04 Tempo (ps) ∆Α
Figura 4.9: Assorbimento in funzione del tempo per λ = 448 nm, in corrispondenza del picco di assorbimento di Mb∗
II
Lo spettro di assorbimento transiente a λprobe= 448 nm, in gura (4.9), presenta una
peculiarità evidente: la creazione della specie che assorbe a questa lunghezza d'onda non è istantanea ma si estende su una scala temporale maggiore della scala di fotolisi, di 50 fs, e ha una dinamica evidente. Abbiamo così eettuato il t bi-esponenziale su tutto lo spettro a λprobe= 450 nm, in modo da descrivere la nascita e il successivo decadimento della specie.
Il risultato si accorda con i dati sperimentali, ed è:
∆A = 5.9 · e−t/0.45ps− 4.9 · e−t/4.4ps
in cui il tempo corto approssima bene l'andamento crescente nel tempo e il tempo lungo quello decrescente. Una possibile interpretazione è quella di trovarsi di fronte a una specie, M b∗II, che non viene creata istantaneamente, ma si popola con un tempo corto, paragonabile al tempo di decadimento di Mb∗
I, e si spopola con un tempo lungo. Questo avvalora l'ipotesi
4.3 Cinetica sui picchi di assorbimento delle specie transienti 4 ANALISI DATI 0 5 10 15 20 25 0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 Tempo (ps) ∆Α
Figura 4.10: Assorbimento in funzione del tempo per λ = 462 nm, in corrispondenza del picco di assorbimento di Mb∗
I
I risultati del t con λprobe = 462nm, in gura (4.10), in corrispondenza del picco di
M b∗I, sono:
∆A = 0.49 · e−t/0.11ps+ 0.51 · e−t/2.6ps
Si nota qui un evidente disaccordo con il modello: in corrispondenza del picco di Mb∗ I si
do-vrebbe osservare un andamento esponenziale con un tempo dominante di ∼ 300fs. Troviamo invece un tempo lungo e uno corto, con pesi di ugual valore, senza dunque una predominanza di un tempo sull'altro. Imputiamo questo risultato ai problemi precedentemente descritti dell'assorbimento transiente sullo studio della singola lunghezza d'onda. Infatti la specie transiente Mb∗
I ha vita particolarmente breve e picco vicino in lunghezza d'onda a quello
delle altre specie transienti. Le code dello spettro di assorbimento transiente di queste ultime in uenzano in maniera non trascurabile la traccia a 462nm, corrispondente a Mb∗
I.
Poiché la specie Mb∗
I ha un tempo di vita molto breve, decidiamo di eettuare un t a
singolo esponenziale no a t = 2 ps - in gura (4.11) - in un tentativo di evitare l'in uenza della coda del picco più vicino, in particolare quello della Mb∗
II che, come è evidente dalla
traccia a 448nm, inizia il decadimento sullo stato fondamentale proprio attorno a questo tempo. Il risultato, in gura (4.11) è ∆A = e−t/0.24ps, in buon accordo con quanto atteso.
4.3 Cinetica sui picchi di assorbimento delle specie transienti 4 ANALISI DATI 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0.035 0.04 0.045 0.05 0.055 Tempo (ps) ∆Α
Figura 4.11: Assorbimento in funzione del tempo per λ = 462 nm, in corrispondenza del picco di assorbimento di Mb∗
I, no a 2ps
4.3.2 La proteina legata con il monossido di carbonio (CO)
Presentiamo in questa sezione i corrispondenti risultati nel caso della proteina legata, MbCO.
0 5 10 15 20 25 30 −0.95 −0.9 −0.85 −0.8 −0.75 −0.7 −0.65 −0.6 Tempo (ps) ∆Α
Figura 4.12: Assorbimento in funzione del tempo per λ = 435 nm, in corrispondenza del picco di assorbimento della proteina non legata
Il risultato del t con λprobe= 435 nm, in gura (4.12), in corrispondenza del picco di
4.3 Cinetica sui picchi di assorbimento delle specie transienti 4 ANALISI DATI
Questo risultato è in ottimo accordo con gli studi precedenti: si osservano un tempo lungo e uno breve, ma questa volta pesati in maniera dierente, a confermare che il canale della M b∗II è inibito nella MbCO. Il rapporto tra i coe cienti dei due esponenziali è stato stimato come inferiore a 1
5 [5]. Il nostro risultato è in buon accordo con questa stima: 0.14 0.86 ' 1 6. 0 5 10 15 20 25 30 35 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 Tempo (ps) ∆Α
Figura 4.13: Assorbimento in funzione del tempo per λ = 448 nm, in corrispondenza del picco di assorbimento di Mb∗
II.
I risultati del t con λprobe = 448 nm, in gura (4.13), in corrispondenza del picco di
M b∗II, sono:
∆A = 1.87 · e−t/0.24ps
− 0.87 · e−t/6.4ps+ 0.25
.
Anche in questo caso, analogamente a quanto osservato nella proteina non legata, si nota che la specie che assorbe a 448 nm viene creata con un tempo che non si può considerare istantaneo. Questo testimonia di una presenza non nulla della specie transiente Mb∗
4.3 Cinetica sui picchi di assorbimento delle specie transienti 4 ANALISI DATI 0 5 10 15 20 25 30 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 Tempo (ps) ∆Α
Figura 4.14: Assorbimento in funzione del tempo per λ = 462 nm, in corrispondenza del picco di assorbimento di Mb∗
I.
I risultati del t con λprobe = 462 nm, in gura (4.14), in corrispondenza del picco di
M b∗I, sono:
∆A = 0.57 · e−t/0.10ps+ 0.42 · e−t/3.1ps+ 0.01
E' evidente che questo risultato è in ciato dalla presenza delle code degli spettri di assorbimento delle altre specie, in quanto ci si aspetta che il decadimento di Mb∗
I sia ben
rappresentato da un singolo decadimento esponenziale con tempo caratteristico di ∼ 300 fs. Analogamente al caso della proteina non legata, eettuiamo un t no a t = 2 ps, riportato in gura (4.15). Anche in questo caso i risultati del t rappresentano meglio il risultato atteso: ∆A = e−t/0.20ps.
0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 Tempo (ps) ∆Α
Figura 4.15: Assorbimento in funzione del tempo per λ = 460 nm, in corrispondenza del picco di assorbimento di Mb∗, no a 2ps
4.3 Cinetica sui picchi di assorbimento delle specie transienti 4 ANALISI DATI
Come si evince dai t unidimensionali n qui presentati, i tempi di decadimento carat-teristici non sono gli stessi a tutte le lunghezze d'onda, come ci aspetteremmo dal modello presentato nella sezione 4.2. Riteniamo che questo sia dovuto alla sovrapposizione delle code degli spettri e alla stretta vicinanza dei picchi delle specie elettroniche in gioco, il che rende di coltoso estrarre l'informazione sulle cinetiche. Un risultato particolarmente importante è l'informazione data dalla traccia a 448 nm, in corrispondenza del picco di Mb∗
II: è evidente
che questa specie viene creata con un tempo maggiore dei ∼ 50fs corrispondenti alla fotolisi. Questo ci permette di escludere l'ipotesi parallela per la foto-cinetica della mioglobina.
Una possibile soluzione al problema della sovrapposizione degli spettri di assorbimento è eettuare un global t, cioè un t simultaneo su tutte le lunghezze d'onda, che ha come unici parametri i tempi caratteristici del sistema. Il modello per l'ipotesi sequenziale che abbiamo sviluppato in precedenza può essere utile per interpretare e confrontare con esso i risultati dell'analisi globale. Questo modello prevede due soli tempi caratteristici del sistema, che riproducono bene gli andamenti sperimentali sui picchi di assorbimento delle specie elettroniche coinvolte nella fotocinetica.
Possiamo inoltre notare che le ampiezze relative dei due decadimenti osservati sperimen-talmente (Aveloce
0 e Alento0 , relative ai due tempi osservati τvelocee τlento) sono completamente
determinate dalle tre frequenze di transizione (k10, k12 e k20) de nite nell'ambito del
mo-dello presentato nella sezione 4.2. Grazie a questo si possono determinare le tre frequenze dai dati sperimentali.
In generale troviamo: Aveloce0 Alento0 = k10− k20 k12 e ricordando che τlento= 1 k20 e τveloce= 1 k10+ k12
otteniamo i seguenti valori per i tempi di transizione: τ20= τlento τ10= 1 +Aveloce 0 /Alento 0 1 τlento+ Aveloce0 /Alento0 τveloce τ12= τveloceτ10 τ10− τveloce
Per quel che riguarda la Deoxy, abbiamo, a 435 nm: Aveloce 0 Alento 0 = 0.69 0.31 τveloce= 0.33ps τlento= 2.4ps e di conseguenza: τ20= 2.4ps τ10= 0.45ps τ12= 1.2ps
4.4 Analisi globale 4 ANALISI DATI
Per quel che riguarda la MbCO, abbiamo, a 435 nm: Aveloce0 Alento 0 = 0.86 0.14 τveloce= 0.21ps τlento= 3.0ps e di conseguenza: τ20= 3.0ps τ10= 0.28ps τ12= 0.84ps
Una semplice simulazione ci permette di ottenere, a partire dalle equazioni dierenziali del modello e da questi valori ricavati sperimentalmente, i pro li di concentrazione aspettati per le tre specie, in gura (4.16) nel caso della mioglobina deoxy:
Figura 4.16: Pro li di concentrazione delle tre specie in funzione del tempo. La concentrazione è normalizzata a 1.
4.4 Analisi globale
L'analisi globale prende in considerazione tutto lo spettro di assorbimento transiente della mioglobina, dunque viene eseguita simultaneamente su tutte le lunghezze d'onda, ed è utile per estrarre la fotocinetica dai dati stessi. Per eettuare l'analisi globale abbiamo usato il pacchetto Matlab Ultrafast Toolbox [8]. Abbiamo eettuato due tipi di analisi su tutto lo spettro di assorbimento transiente della proteina non legata: la Singular Value Decomposi-tion (SVD) e il global t. La prima tecnica è essenzialmente una procedura matematica che ha come obiettivo la stima del numero di processi attivi presenti nel sistema; la seconda è un t simultaneo su tutto lo spettro che ha come unici parametri i tempi caratteristici del sistema, e a ognuno di essi associa uno spettro funzione della lunghezza d'onda. Tramite questi spettri e i tempi caratteristici a loro associati si può ricostruire il segnale a tutte le lunghezza d'onda. Confronteremo poi i risultati del global t con gli andamenti predetti dal modello.
4.4.1 Singular Value Decomposition (SVD)
La Singular Value Decomposition è una procedura che decompone i dati (nel nostro caso, di assorbimento transiente) X(λ, t) = X(1, ..., m, 1..., n) contenenti m righe (corrispondenti ai tempi) ed n colonne (corrispondenti agli spettri) nel seguente modo:
4.4 Analisi globale 4 ANALISI DATI
X = U · S · V0
Dove S è una matrice diagonale di dimensione m × n che contiene le singular values (in ordine decrescente all'aumentare del numero di riga), U(1, ..., m, k) (left singular vectors, LSV) contiene le tracce nel dominio del tempo e V (1, ..., m, k) (right singular vectors, RSV) in quello spettrale, corrispondenti alla singular value S(k, k).
LA SVD può essere pensata come la decomposizione di una matrice in una somma pesata ordinata di matrici di base. Matrici che risultano inoltre separabili nel senso che possono essere scritte come prodotto esterno di due vettori, cioè A = u ⊗ v, o in coordinate A(i,j)=u(i)v(j). Si ottiene così X = PiσiUi⊗ V
0
i, dove le σi sono le singular values.
In generale, le singular value più alte contengono il segnale rilevante, mentre le più basse rappresentano il rumore. La SVD è generalmente usata per stimare il numero di componenti presenti nei dati, di cui determina una base di componenti ortogonali che può riprodurre gli stessi tramite combinazione lineare, e che non hanno un necessario signi cato sico.
Si può comunque eseguire un t su una selezione delle tracce temporali determinate dall'SVD (quelle che hanno singular values dominanti). Questo t può essere usato per ricavare una prima stima, almeno in ordine di grandezza, dei tempi caratteristici del sistema [8].
Riportiamo nella gura (4.17) i risultati della Singular Value Decomposition applicata ai dati di assorbimento transiente della mioglobina deoxy.
2 4 6 8 10 −0.3 −0.25 −0.2 −0.15 −0.1 −0.05 Tempo (ps) LSV SV = 1 fit LSV 350 400 450 500 550 600 −0.05 0 0.05 0.1 SV = 1 RSV Lunghezza d’onda (nm) 2 4 6 8 10 −0.3 −0.2 −0.1 0 SV = 2 Tempo (ps) 350 400 450 500 550 600 0 0.05 0.1 SV = 2 Lunghezza d’onda (nm) 20 40 60 80 100 120 0.5 1 1.5 2 2.5 3 Singular values (SV) SV number SV
SVD analysis of selected number of components
Figura 4.17: Risultati dell'analisi tramite SVD. Si noti (nel gra co in alto a destra) come le prime due componenti siano preponderanti rispetto alle altre, cioè come abbiano singular value dominante. Queste due componenti sono dunque presentate, nelle altre quattro gure, sia nel dominio del tempo (LSV) sia in lunghezza d'onda (RSV).
L'SVD conferma la presenza di due processi dominanti sugli altri, in accordo con le nostre aspettative (ci aspettiamo infatti due spettri di base, cioè due soli tempi caratteristici
4.4 Analisi globale 4 ANALISI DATI
del sistema, come mostrato nel modello sequenziale). Una prima stima di questi tempi è τ1 = 0.53 ps e τ2 = 6.1 ps, sovrastimati rispetto a quelli ricavati dai t sulla singola
lunghezza d'onda. Si può notare la presenza di un terzo processo non del tutto trascurabile, che intepreteremo nel seguito in termini di un processo di distorsione dei picchi, il cooling vibrazionale. Abbiamo deciso di trattare in questa sezione solo i due processi dominanti, il terzo sarà trattato nelle sezioni 4.4.2 e 4.5.
4.4.2 Global t
Un global t è un potente strumento che permette l'estrazione delle informazioni in-dipendenti dal tempo (come la forma degli spettri che rappresentano una transizione in un esperimento di spettroscopia) presenti nei dati. Questo approccio sempli ca di molto l'interpretazione delle dinamiche osservate riducendo la dimensionalità del problema, cioè descrivendo i dati tramite spettri indipendenti dal tempo.
La procedura di t del pacchetto Ultrafast Toolbox usa due metodi dierenti, la ricerca basata sul gradiente e quella diretta, per analizzare i dati (dipendenti dal tempo) X(t) [8]. Queste procedure di t sono basate sul calcolo e la minimizzazione della somma dei residui:
minX(X(t) − X(t))2 (4.1)
dove X(t) è la matrice di dati aspettata. Un metodo ampiamente impiegato per minimizzare una funzione di questo tipo è l'analisi dei minimi quadrati non lineare. A questo scopo si usa un metodo basato sul gradiente dove la dierenziabilità della funzione è essenziale dal momento che la derivata prima della funzione di errore (4.1) dev'essere calcolata (iterativa-mente). Se il problema è multidimensionale (come nel nostro caso, il problema si pone su varie lunghezze d'onda), bisogna cercare il minimo assoluto su di una super cie. Il problema dei metodi basati sul gradiente è che un gradiente alto in un punto può portare a minimiz-zare la funzione su di un minimo locale. Una possibile soluzione è usare dierenti valori di partenza (random), anche se in teoria se ne dovrebbero usare un numero in nito.
Un metodo di ricerca diretto può essere più potente nella de nizione di un minimo assoluto, poiché ha una tendenza più bassa a restare in un minimo locale. In questo caso si costruisce una griglia attorno ad un punto di partenza sulla super cie in questione (su cui non c'è richiesta di dierenziabilità né di continuità) e conseguentemente tutte le direzioni sono iterativamente scansionate. Se l'algoritmo incontra un valore più basso (ricordiamo che stiamo parlando della somma dei residui de nita nell'equazione precedente), il nuovo valore diventa il nuovo punto di partenza, e l'algoritmo riparte, ma con una griglia più grande. La dimensione della griglia diminuisce se tutti i punti scansionati hanno un valore più alto di quello del punto di partenza. Questo tipo di algoritmo è detto patternsearch ed è particolarmente e ciente nell'ottimizzazione di problemi ad alta dimensionalità.
Nella spettroscopia ultraveloce, come mostrato nel paragrafo 1.2, si usano andamenti esponenziali per descrivere processi come i segnali di assorbimento transiente:
X(t) = y0+ n
X
i=1
4.4 Analisi globale 4 ANALISI DATI
Dove y0 rappresenta la baseline (che può essere dovuta, per esempio, a una
ricombina-zione geminata), Ai le ampiezze - indipendenti dal tempo - e τi le costanti di tempo per
ognuno degli n esponenziali che determinano la concentrazione o la popolazione degli stati. In un esperimento di assorbimento transiente gli Airappresentano gli spettri corrispondenti
ai processi che avvengono nella matrice dei dati (sono dunque una funzione di λ) e i τi i loro
rispettivi tempi caratteristici.
Nel caso di decadimenti multi-esponenziali, bisogna fornire al programma un modello di connessione tra gli stati su cui eseguire il global t dei dati, che può essere creato tramite un'interfaccia gra ca intuitiva sul pacchetto Matlab SimBiology ed esportato in formato xml utilizzabile da Ultrafast Toolbox. In questo modo possiamo inserire il modello che abbiamo proposto nella sezione 4.2. L'approccio usato da SimBiology è quello di risolvere il problema numericamente, cioè di risolvere il sistema di equazioni dierenziali ordinarie per le concentrazioni dipendenti dal tempo di ogni componente. La somma delle concentrazioni di tutte le componenti allo stesso istante di tempo è normalizzata a 1.
L'obbiettivo dell'analisi globale è quello di estrarre dai dati gli spettri indipendenti dal tempo Ai(λ)e le costanti di tempo τi, de nite dal modello. Le costanti di tempo sono comuni
indipendentemente a tutte le lunghe d'onda misurate, mentre le ampiezze a loro associate possono variare su ogni lunghezza d'onda. Il metodo di lavoro di Ultrafast Toolbox è quello di generare prima i pro li di concentrazione (dipendenti dal modello, nel nostro caso quello dell'ipotesi sequenziale descritta nella sezione 4.2) ed eettuando un t di questi ultimi sui dati, estrarre gli spettri e le costanti di tempo [8].
Riportiamo nelle gure (4.19) e (4.20) i risultati del global t eettuato sull'intero spettro di assorbimento transiente della mioglobina non legata.
4.4 Analisi globale 4 ANALISI DATI
Figura 4.18: Figura in alto: Dati caricati dello spettro di assorbimento della mioglobina deoxy (griglia nera) e global t sui dati (a colori). In basso: pro li di concentrazione in funzione del tempo per le tre specie elettroniche, risultato del t sui dati. In verde f0,
corrispondente alla proteina non legata, in rosso f2, corrispondente a Mb∗II, e in blu f1,
corrispondente a Mb∗
I. Gli andamenti sono in accordo con quelli ipotizzati nel modello
sequenziale. 420 430 440 450 460 470 480 490 −0.15 −0.1 −0.05 0 0.05 Lunghezza d’onda (nm) ∆Α
Figura 4.19: Spettri indipendenti dal tempo per le tre specie elettroniche. I risultati estratti dal global t per i tempi caratteristici sono
4.4 Analisi globale 4 ANALISI DATI
rispettivamente associati agli spettri in blu, rosso e verde. Le tre linee orizzontali stanno a indicare la posizione dei picchi di assorbimento delle tre specie coinvolte nella reazione, nell'ordine la proteina non legata (435 nm), Mb∗
I (448 nm) e Mb∗II (462 nm).
Possiamo interpretare come un processo di scomparsa della mioglobina deoxy e compar-sa dello stato eccitato Mb∗
I lo spettro associato al tempo corto (in blu) e come scomparsa
della mioglobina deoxy e comparsa dello stato eccitato Mb∗
II lo spettro associato al tempo
lungo (in rosso). Ci aspettiamo, come mostrato precedentemente, la presenza di soli due tempi caratteristici del sistema, anche se il modello necessita di tre frequenze di transizione. Lo spettro in verde dovrebbe dunque apparire piatto per rispettare il nostro modello. La distorsione di questo spettro rispetto al valore nullo costante può essere interpretato tramite la presenza del fenomeno di cooling vibrazionale, un fenomeno di spostamento dei picchi di assorbimento nel tempo che discuteremo nella sezione 4.5. L'intepretazione di uno degli spettri caratteristici risultanti dal global t in termini di un processo di rilassamento vibra-zionale è stata data anche in altri studi [9]. Abbiamo così spiegato la presenza del terzo processo non trascurabile che appariva nell'SVD.
Possiamo in seguito eseguire un confronto tra gli andamenti attesi - calcolati in base al modello presentato nella sezione 4.2, inserendovi le frequenze di transizione stimate nella sezione 4.3 - e gli andamenti predetti da quest'ultimo sulle tre lunghezze d'onda corrispon-denti ai picchi di assorbimento degli stati elettronici coinvolti, calcolati secondo la formula (4.1). Riportiamo in blu gli andamenti ottenuti dal modello e in azzurro quelli ricavati dal global t. 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 Tempo (ps) ∆Α
Figura 4.20: Confronto tra gli andamenti risultanti dal modello sequenziale e dal global t in funzione del tempo a λ = 435 nm, in corrispondenza del picco di assorbimento della proteina non legata
4.4 Analisi globale 4 ANALISI DATI 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 −0.4 −0.3 −0.2 −0.1 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 Tempo (ps) ∆Α
Figura 4.21: Confronto tra gli andamenti risultanti dal modello sequenziale e dal global t in funzione del tempo a λ = 448 nm, in corrispondenza del picco di assorbimento di Mb∗
II 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 Tempo (ps) ∆Α
Figura 4.22: Confronto tra gli andamenti risultanti dal modello sequenziale e dal global t in funzione del tempo a λ = 460 nm, in corrispondenza del picco di assorbimento di Mb∗
I
Come si può vedere, i tempi sono sovrastimati, ma gli andamenti sono rispettati. Inter-pretiamo questa sovrastima in termini della presenza del cooling vibrazionale.
4.5 Cooling vibrazionale 4 ANALISI DATI
4.5 Cooling vibrazionale
Il cooling vibrazionale è il fenomeno per cui il picco di assorbimento di una certa specie elet-tronica si sposta in lunghezza d'onda durante la misura, a causa di eetti di rareddamento del campione nel tempo. Infatti, la fotoeccitazione all'origine delle transizioni elettroniche ri-sulta in specie eccitate con energia vibrazionale in eccesso localizzata in una o più vibrazioni attive di Franck-Condon [10].
Un prerequisito all'uso del global t è che i dati consistano in una combinazione lineare di componenti indipendenti dal tempo. Questo non è vero se il cooling vibrazionale porta a un cambiamento nel tempo della frequenza vibrazionale [8]. Questo fenomeno ha un'importanza non trascurabile nelle cinetiche da noi presentate.
Possiamo monitorare lo spostamento dei picchi dello spettro totale di assorbimento tran-siente in funzione del tempo, al ne di studiare il processo di cooling vibrazionale. Ri-cordiamo che questi picchi non rappresentano quelli di una data specie elettronica, ma dell'assorbimento transiente globale.
Per studiare la posizione dei picchi in funzione del tempo una possibilità è eseguire un t sui dati con una combinazione lineare di due gaussiane, con una funzione del tipo
f (t) = a1· e− (x−b1) c1 2 + a2· e− (x−b2) c2 2
dove b1 e b2 sono in buon accordo con la posizione reale dei picchi dello spettro di
as-sorbimento transiente. Questo è uno strumento per studiarne la posizione in funzione del tempo e per riprodurne la forma funzionale, anche se a priori quest'ultima non è gaussiana. Tuttavia l'andamento - sia nella proteina legata sia in quella non legata - è riprodotto in ottima approssimazione da questa forma funzionale, come mostrato in gura (4.24), nella quale riportiamo un esempio per quel che riguarda lo spettro di assorbimento transiente della proteina legata a t = 1.63 ps.
400 410 420 430 440 450 460 470 −1 −0.8 −0.6 −0.4 −0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 Lunghezza d’onda (nm) ∆Α
Figura 4.23: Spettro di assorbimento transiente in funzione della lunghezza d'onda a t = 1.63 ps. Il t è riportato in gura: ∆A = −1.1 · e−
(x−423nm) 2,9nm2
2
+ 0.63 · e−(x−438)3.9nm2 2
4.5 Cooling vibrazionale 4 ANALISI DATI
4.5.1 Spostamento dei picchi dello spettro di assorbimento transiente della proteina non legata
In questa sezione presentiamo i dati relativi alla dinamica di cooling vibrazionale - nel caso della proteina non legata - in corrispondenza sia della scomparsa della specie non legata sia della comparsa dello stato elettronico eccitato Mb∗
II.
Il minimo dell'assorbimento transiente, in prossimità dunque della mioglobina non legata è ben rappresentato, no a ∼ 7 ps, da un singolo esponenziale, come mostrato in gura (4.25).
0 1 2 3 4 5 6 7 420 422 424 426 428 430 432 434 436 Tempo (ps) Lunghezza d’onda (nm)
Figura 4.24: Posizione del picco dell'assorbimento transiente in prossimità della scomparsa della mioglobina deoxy in funzione del tempo. f(t) = (15 · e−x/2.2ps+ 421) nm
Il risultato per il tempo caratteristico è τD= 2.2 ps.
Il cooling corrisponde a ∼ 14 nm, ed è dunque importante, e non trascurabile nei nostri dati in quanto il suo tempo caratteristico è confrontabile con quelli delle specie elettroniche in gioco.
Inoltre, anche il massimo dell'assorbimento transiente, in prossimità della specie elet-tronica Mb∗
II, è soggetto ad un andamento dello stesso tipo, il che conferma che Mb∗II
corrisponde ad uno stato eccitato vibrazionalmente caldo. In gura (4.26) riportiamo il t a singolo esponenziale eettuato sulla posizione di questo picco, che presenta un tempo caratteristico τDII = 1.8 ps. 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 446 446.5 447 447.5 448 448.5 449 Tempo (ps) Lunghezza d’onda (nm)
Figura 4.25: Posizione del picco dell'assorbimento transiente attorno a 450 nm (in prossimità della comparsa della specie Mb∗
