Volendo dedicarci allo studio delle differenze biologiche che potrebbero eventualmente esistere tra le diverse cellule di melanoma e che potrebbero
80 dipendere da differenze nell’espressione del miRNA, abbiamo deciso di costruire un sensore per il miR-204 (più un sensore di controllo che non si lega ad alcun miRNA).
Il sensore non è altro che una serie di siti target sintetici per uno specifico miRNA inseriti all’interno di un vettore di espressione genica, che quando verranno trascritti saranno legati dal miRNA endogeno[76]. Quando questi targets sono espressi a livelli fisiologici, essi possono “sentire” l’attività del miRNA nelle cellule [77,78]. Inoltre questi siti di target sono perfettamente complementari al miRNA a cui si devono legare (differentemente dalle sponges), per cui avviene il taglio endonucleolitico. In questo modo il sensore risulta più sensibile e interferisce meno con l’attività del miRNA. Dunque ci siamo dedicati alla costruzione del sensore e al suo utilizzo basandoci in parte sul lavoro di Mullokandov e collaboratori [79].
Dopo aver clonato le 6 copie del sensore all’interno del pNot (x), nello stesso modo di come era stato fatto per la sponge, il sensore è stato sub-clonato in dei vettori plasmidici virali che presentano due geni reporter differenti. I costrutti che sono stati preparati sono quindi due: uno presenta come vettore di base il PIG, con il reporter mCherry a monte del sensore e la EGFP sotto il controllo del promotore costitutivo CMV (Figura 3-24); l’altro presenta come vettore di base il PImC, ossia un PIG modificato dove i reporter sono invertiti (Figura 3-25). Inoltre in quest’ultimo caso, al posto della EGFP è stata inserita una
destabilizedGFP (deGFP), ossia una GFP che presenta un dominio di
degradazione fuso all’estremità carbossi-terminale della proteina e che quindi comporta un’emivita della fluorescenza molto minore rispetto alla EGFP. Essa dovrebbe aiutare a valutare meglio l’effetto della famiglia del miRNA in quanto la deGFP presenta un’espressione più dinamica ed è quindi più sensibile a variazioni della famiglia (rispetto alla EGFP).
81 Dunque tramite Cell sorting le cellule transfettate saranno separate in base ai livelli di espressione del miRNA (bassa/media/alta espressione), in quanto ci aspetteremo che le cellule esprimano tutte il reporter sotto il controllo del promotore costitutivo, mentre l’altro reporter sarà espresso in quantità diverse o non espresso a seconda dei livelli di espressione del miRNA in quelle cellule. Tutto ciò permetterà di studiare le eventuali differenze che potrebbero riscontrarsi tra i vari gruppi di cellule.
82 Figura 3-25 – Sensore per il miR-204 contenuto nel PImC
4 Discussione
Il melanoma è un tumore particolarmente aggressivo la cui frequenza nella popolazione mondiale è in rapido aumento. Nei primi stadi della malattia la rimozione chirurgica del tumore garantisce che la sopravvivenza del paziente a 10 anni sia del 90%. Quando però il tumore raggiunge stadi tardivi (Fase IV, melanoma metastatico) l’aspettativa di vita del paziente varia tra sei mesi ed un anno. Negli ultimi anni la ricerca si è concentrata sullo studio del profilo molecolare dei vari tipi di tumore. La scoperta di mutazioni più rappresentate in alcuni tipi di tumore piuttosto che in altri ha permesso lo sviluppo di nuovi agenti antitumorali mirati. Nel caso del melanoma, la genotipizzazione di biopsie ha mostrato che nel 60% dei casi è presente una mutazione del gene BRAF a livello del codone che codifica per V600. La chinasi BRAFV600E è stata quindi individuata come possibile target terapeutico specifico per la cura del melanoma
83 metastatico. Le ricerche hanno condotto allo sviluppo di una nuova classe di farmaci antitumorali che vanno a inibire BRAF mutato. Tra questi troviamo il Vemurafenib (PLX 4032), del quale è stato approvato l’uso da parte della FDA nel 2011 negli USA e in Europa nel 2012. Questo farmaco provoca un’inibizione selettiva di BRAF V600E inibendo il pathway MAPK. Nel 50% dei casi l’azione del Vemurafenib provoca una regressione completa delle metastasi nel giro di pochi mesi. Tuttavia, dopo circa 6 mesi di trattamento con il farmaco, si osserva che la totalità dei pazienti, che inizialmente rispondono al trattamento, ha una ricaduta con ricomparsa delle metastasi e una nuova progressione della malattia; questo fenomeno viene definito resistenza acquisita e rappresenta un grosso limite per questo farmaco. È quindi di grande importanza individuare i meccanismi molecolari che causano la resistenza acquisita, in modo da poter intervenire su di essi e prevenirla.
Molti lavori testimoniano l’importanza dei miRNA nel cancro dato il loro ruolo sia come miRNA oncosoppressori che come miRNA oncogeni. Inoltre una serie di lavori dimostrano il coinvolgimento di specifici miRNA nello sviluppo del melanoma.
Detto questo e data l’importanza di BRAF come target farmacologico nel melanoma, la mia tesi è stata volta a studiare i miRNA regolati da BRAF nel melanoma.
Il primo passo è consistito nell’identificare i miRNA regolati dal BRAF mutato (BRAFV600E) tramite un deep sequencing approntato su una linea cellulare sensibile al farmaco e la sua controparte resistente, quando BRAFV600E e quindi il MAPK pathway sono inibiti o meno dal farmaco. Dopo aver fatto un’accurata selezione di questi miRNA, si è arrivati all’identificazione di una serie di miRNA tra i quali il top scoring è il miR-204. Questo fa parte di una famiglia di miRNA
84 insieme al miR-211, il quale differisce dal miR-204 solo per due basi al di fuori del
seed. Per questo motivo si è deciso di studiare entrambi i miRNA.
I dati del deep sequencing approntati sulla linea cellulare A375 mostravano come il miR-204 fosse sovraregolato nella linea parentale, ma non nel clone resistente C2, dopo trattamento col farmaco. Tramite Real-Time PCR questi dati sono stati confermati, utilizzando però un primer specifico per la famiglia e che quindi non distinguesse tra i due miRNA. Nella linea A375 il problema non si poneva in quanto le cellule non presentano il gene TRPM1 al cui interno si trova il miR-211. In seguito si è voluto confermare sempre tramite Real-Time che un simile andamento si riscontrasse anche in altre linee parentali e relativi cloni/popolazioni resistenti, dove i meccanismi di resistenza erano anche differenti rispetto al clone C2.
In seguito sono stati confermati dati di letteratura che indicavano come TRPM1 e TRPM3 fossero co-espressi rispettivamente con i miR-204 e miR-211.
Successivamente sono stati studiati gli effetti del miR-204 e del miR-211 quando questi sono sovraespressi nelle cellule della linea 501-MEL, la quale presenta l’espressione di entrambi i miRNA a differenza della linea A375. Dunque ci siamo anzitutto dedicati a provare due saggi cellulari a seguito di transfezione stabile del miR-204 al fine di farlo sovraesprimere. La curva a diverse dosi e il saggio clonogenico hanno mostrato che le cellule della linea 501-MEL crescono meno se transfettate col miR-204. Ciò dovrebbe suggerire il ruolo oncosoppressivo del miRNA come già riportato in letteratura [80-86]. In seguito ci siamo dedicati al saggio della melanina, che è stato utilizzato basandoci sull’idea che il Vemurafenib attiva un programma di differenziamento aumentando la produzione di melanina, ossia il compito molto “specialistico” dei melanociti, da cui derivano le cellule tumorali di melanoma. Da questo saggio si è ottenuto che
85 la sovraespressione dei miR-204 e miR-211 incrementa gli effetti del Vemurafenib in termini di produzione di melanina e che il fenotipo viene recuperato transfettando le cellule anche con l’inibitore del miR-204. Inoltre inibendo il miR-211 endogeno tramite LNA non si ha produzione di melanina. Sembra perciò che questo miRNA sia richiesto alle cellule per differenziare, cioè che il programma di differenziazione cellulare dovuta al Vemurafenib passi attraverso il miR-211.
La famiglia del miR-204 ha un’espressione lineage specifica, per questo ci si è chiesti cosa succede quando viene inibita. Inibendo i miRNA in linee cellulari sensibili e resistenti al farmaco tramite LNA è stato osservato un aumento dell’apoptosi andando ad inibire il miR-204, mentre non si osserva lo stesso risultato andando a inibire il miR-211. Per confermare questi dati ci siamo dedicati alla costruzione delle sponges contro i due miRNA, con la prospettiva futura di studiarne gli effetti sulle varie linee cellulari infettate stabilmente tramite vettori plasmidici virali e validare quindi i dati ottenuti dalla transfezione transiente.
Intanto il saggio della luciferasi ha già permesso di confermare che le sponge sono comunque funzionali, nonostante non siano specifiche per uno dei due miRNA, data la loro forte omologia. Per questo motivo la sponge che verrà infettata stabilmente sarà costituita dalle 6 copie della sponge contro il miR-204 più le 6 copie della sponge contro il miR-211.
L’ultima parte della mia tesi è stata dedicata alla costruzione di un sensore per il miR-204 allo scopo di suddividere le cellule di una data linea cellulare in più gruppi a seconda dell’espressione del miRNA e poter studiare le probabili differenze biologiche esistenti tra questi gruppi e che dipenderanno da questa espressione differente. Nel fare ciò sono state inserite 6 copie del sensore del
86 miR-204 a valle di un reporter all’interno di un vettore plasmidico virale, in cui vi era un differente reporter sotto il controllo del promotore costitutivo CMV (Citomegalovirus). I vari gruppi di cellule verranno suddivisi tramite Cell sorting e quindi in base all’espressione del reporter sotto cui si trova il sensore: più è espresso il reporter, meno è espresso il miR-204 e viceversa.
I mir-204 e miR-211 sono stati studiati su vari tipi di tumore incluso, per quanto riguarda il miR-211, il melanoma.
In generale è stato dimostrato che hanno un ruolo oncosoppressivo, in accordo con il fatto che questi due miRNA sono indotti dal Vemurafenib, il quale inibisce il pathway delle MAPK, che nel melanoma risulta essere un pathway oncogenico. Molti lavori hanno mostrato come il miR-204 fosse un miRNA antitumorale e di conseguenza spesso sottoregolato nelle cellule tumorali. Nel tumore al pancreas regola Mcl-1, i cui livelli diminuiscono se si sovraesprime il miRNA, portando ad apoptosi cellulare[80]. Nel carcinoma endometriale miR-204 controlla TrkB, che promuove la metastasi, inibendo significativamente la crescita clonogenica, la migrazione e l’invasione delle Endometrial Cancer cells; inoltre inibisce la crescita del tumore di xenografts in topo. Infine una bassa espressione del 204 è associata a metastasi dei linfonodi e ad una bassa chance di sopravvivenza per i pazienti[81]. Stessa conseguenza è stata riscontrata nel colangiocarcinoma intraepatico, dove è stata osservata anche una reversione dell’EMT (transizione epitelio mesenchimale) dovuta proprio a una sovraespressione del miR-204 [82]. Nel glioma, riportando il miRNA a livelli fisiologici, si ha una riduzione della tumorigenesi e l’invasività in vivo[83]. Nel cancro allo stomaco, il miR-204 riesce a revertire l’EMT, la resistenza all’anoikis e l’invasività [84]. Esiste anche un ulteriore lavoro in cui viene dimostrato che la mancanza del miR-204 in svariati cancri porta ad un aumento dell’invasività. Questo aumento è dovuto ad una
87 sovraespressione di BDNF, con conseguente attivazione della GTPasi RAC1 e riorganizzazione dell’actina attraverso il signaling AKT/mTOR, portando quindi ad una migrazione delle cellule cancerose[85]. Vista l’importanza del miR-204 nel cancro e la sua presenza nel siero di pazienti con cancro endometriale, è stato suggerito un suo utilizzo come biomarker tumorale[86].
Per quanto riguarda il miR-211 e TRPM1, si pensava che il gene fosse un soppressore tumorale, ma in realtà lo è il miRNA al suo interno, infatti aumentando l’espressione di quest’ultimo, ma non di TRPM1, si osserva una ridotta migrazione e invasione delle cellule metastatiche di melanoma[87]. Questo effetto è probabilmente dovuto alla presenza di BRN2 tra i suoi
target[88].
Per quanto riguarda la concomitante funzione di entrambi i miRNAs, è stato visto che nell’RPE (Retinal Pigment Epithelium) questi sono entrambi sottoregolati in cellule de-differenziate, ossia cellule che portano a varie malattie oculari[89]. Tuttavia i dati che sono stati ottenuti dalla mia tesi lasciano ipotizzare che il miR- 211 e forse ancora di più il miR-204 abbiano nel melanoma un ruolo più complesso di quanto ipotizzato fin ora. Se gli studi di sovraespressione complessivamente inducono una funzione oncosoppressiva, quelli di inibizione evidenziano come il miR-204 sia necessario per la sopravvivenza alle cellule di melanoma a prescindere dal loro stato mutazionale (BRAFV600E e wt) e dalla loro sensibilità al Vemurafenib. Questa dose-dipendenza del miR-204 merita di essere studiata in modo più approfondito e ciò sarà fatto anche tramite i costrutti che sono stati preparati durante il mio lavoro di tesi.
88
5 Conclusione
In conclusione nella mia tesi:
sono stati identificati i miR-204 e miR-211 (facenti parte della stessa famiglia) come miRNA regolati da BRAF;
è stato mostrato come le cellule crescano meno e producano melanina dopo sovraespressione della famiglia;
è stato mostrato tramite studi di inibizione che il miR-204 è essenziale per la sopravvivenza cellulare;
sono stati elaborati dei costrutti quali la sponge e il sensore; il primo permetterà di confermare i saggi di apoptosi, il secondo di distinguere le cellule per quantità di espressione della famiglia del miRNA e quindi studiare le eventuali differenze tra i vari gruppi di cellule così distinti.
89
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