L’estrazione dell’RNA totale da pellet cellulari è stata effettuata utilizzando il protocollo TRIZOL (TRIZOL Reagent, Invitrogen). I pellet sono stati lisati con 500μL di TRIZOL e incubati 5 minuti a temperatura ambiente. Al campione
39 omogenato sono stati aggiunti 100 μL di cloroformio e successivamente è stata effettuata una centrifugazione a 12000g per 15minuti, a 4°C. Viene raccolta la fase acquosa, alla quale vengono aggiunti 250 μL di isopropanolo. Segue una centrifugazione a 12000g per 10 minuti. Si rimuove il sovranatante e si lava il pellet con 500μL di etanolo 70%. Il pellet viene poi centrifugato per 5minuti a 7500g. L’RNA precipitato è risospeso in acqua RNase-free e quantificato.
Prima di procedere alla retrotrascrizione, viene effettuato il trattamento con la DNasi I [Deoxyribonuclease I (1U/μL), Amplification Grade, Invitrogen]. La mix di reazione viene lasciata per 15 minuti a temperatura ambiente e contiene:
Componente Volume RNA template 1μg DNAse I 1 μL 10X DNase I Reaction Buffer 1 μL Acqua nuclease- free variabile Volume finale 10 μL
Dopo viene aggiunto 1 µl di EDTA 25 nM (acido etilendiamminotetraacetico) e la DNasi viene inattivata ponendo i campioni a 65°C per 15 min.
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2.9 Retrotrascrizione dell’RNA
Per retrotrascrivere l’RNA estratto dalle nostre linee cellulari ed ottenere il cDNA, viene utilizzato l’iScript Reverse Transcription Supermix for RTqPCR (BIORAD).
La mix di reazione contiene:
Componente Volume Condizioni
iScript reverse transcription
supermix 4 μL
25°C per 5 minuti
RNA template 500 ng 42°C per 30
Acqua nuclease-free variabile minuti 48°C per 10
Volume totale 20 μL
minuti
85°C per 5 minuti
Per poter studiare l’espressione della famiglia del miR-204 viene invece utilizzato un altro metodo di retrotrascrizione, ossia il miScript II RT Kit (Qiagen), che permette la retrotrascrizione dei miRNA.
41 La mix di reazione contiene:
Componente Volume Condizioni
Buffer Hi-Spec 5x 4 µL 37°C per 1 ora
95°C per 5 minuti
Nucleic Acids (dNTP) 10x 2 µL
miR Script RT 2 µL
RNA template 250 ng
Acqua nuclease-free variabile
Volume totale 20 µL
Una volta ottenuto il cDNA si fa un controllo per essere certi che non ci sia stata contaminazione da DNA genomico. Tale controllo viene fatto tramite una PCR in cui confronto l’amplificazione di un frammento del gene ATP1A1 sui cDNA ottenuti e sul DNA genomico. I primers utilizzati danno un amplificato di circa 500 pb con DNA genomico come template e di circa 350 pb con cDNA come
template. Questo perché i primers sono stati disegnati su due esoni al cui interno
vi è un introne lungo 140 pb. Qui sono riportate la mix e le sequenze dei primers: Componente Volume Condizioni
PCR Master Mix
(ThermoScientific)
10 µL 98°C per 2 minuti {95°C per 30 secondi 55°C per 5 secondi
72°C per 30 secondi}x34 cicli 72°C per 7 minuti
ATP1A1 forward 10 µM 1 µL ATP1A1 reverse 10 µM 1 µL cDNA template (diluito) 1 µL Acqua nuclease-free 7 µL
42 Geni Primers
ATP1A1 F 5’ – CTCAGATGTGTCCAAGCAAG – 3’ R 5’ – GTCAGTGCCCAAGTCAATG – 3’
2.10 PCR del pre-miR-204
Per amplificare il pre-miR-204 da DNA genomico è stata usata la Phusion High-
Fidelity DNA Polymerase (ThermoScientific), ossia una Taq polimerasi con proofreading. Qui sono riportate la mix e le sequenze dei primers (che
contengono anche i siti di taglio per XhoI e MLuI) e del pre-miR-204 short (in rosso):
Componente Volume Condizioni
Master Mix Phusion 10 µL 98°C per 10 secondi
{98°C per 1 secondo 55°C per 5 secondi
72°C per 15 secondi}x34 cicli 72°C per 7 minuti primer forward 10 µM 1 µL primer reverse 10 µM 1 µL Genomico 10 ng/µL 2 µL Acqua nuclease-free 6 µL Volume totale 20 µL Template Primers Pre-miR-204 F 5’ – CATCTCGAGGACAGGGTGATGGAAAGGAG – 3’ R 5’ – GCAACGCGTGCATTTGATGATGGTGCAAT – 3’ (XhoI, MluI)
43 In seguito l’amplificato è stato clonato all’interno del pGIPZ (Figura 2-3) tra i siti di restrizione XhoI e MluI.
Figura 2-3 – pGipz (Open Biosystems)
CTCGAGgacagggtgatggaaaggagggtgggggtggaggcaagcagaggacttcctgatcgcgtac
ccatggctacagtctttcttcatgtgactcgtggacttccctttgtcatcctatgcctgagaatatatgaagga ggctgggaaggcaaagggacgttcaattgtcatcactggcatcttttttgatcattgcaccatcatcaaatgc
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2.11 Effetto Vemurafenib a 48 h
Per poter valutare l’effetto del Vemurafenib sui livelli di mRNA di TRPM1, TRPM3 e sui livelli del miR-204 family nelle varie linee cellulari, l’esperimento è stato condotto come segue:
primo giorno: semina di 4 per 105 cellule in p100 (2 piastre per ogni linea);
secondo giorno: trattamento con 10 µL di Vemurafenib 2 µM in una piastra e 10 µL di DMSO nell’altra piastra;
terzo giorno: raccolta dei pellet di cellule (ogni pellet deve essere costituito da circa 1 milione di cellule)
Una volta estratto l’RNA dalle cellule si è proseguiti con la Real-Time PCR dei geni TRPM1 e TRPM3 e del miR-204 family.
2.12 Real-time PCR
L’espressione dei geni TRPM1 e TRPM3, come anche l’espressione della famiglia del miR-204 è stata esaminata tramite Real-Time PCR sul DNA genomico delle varie linee cellulari. Le reazioni vengono effettuate utilizzando SsoAdvanced
SYBR Green Supermix (BIORAD), contenente uno specifico buffer di reazione con
45 Componente Volume Condizioni
SsoAdvancedTM SYBR Green Supermix
7,5 μL 98°C per 30 secondi {98°C per 3 secondi 58°C per 20 secondi
72°C per 10 secondi}x39 cicli 65°C per 31 secondi
{65°C per 1 secondo + 0.5°C/ciclo}x60 cicli
primer forward 10 μM 0,6 μL
primer reverse 10 μM 0,6 μL
Acqua nuclease free 5,3 μL
cDNA 1 μL Volume totale 15 μL Geni/miRNA Primers TRPM1 F 5’ – TGCGAAGGCTGCTGGAAA – 3’ R 5’ – CAAGACGATGGACACCACGTTAGG – 3’ TRPM3 F 5’ – GGAGCAGAGGTGAAACTTCG – 3’ R 5’ – CCCATCACAGACAACCACTG – 3’
miR-204 family F 5’ – TTCCCTTTGTCATCCT – 3’
R 5’ – TGAATCGAGCACCAGTTACGC – 3’
2.13 Deep sequencing
I campioni per l’estrazione dei miRNA destinati al Deep sequencing sono stati preparati a partire dalla semina di a 4*105 cellule della linea A375 e 2.2, ciascuno
nel proprio mezzo di crescita. Dopo 24h sono state trattate con DMSO o Vemurafenib. Dopo 72h dalla semina, le cellule sono state poi lavate con versene e successivamente tripsinizzate. Dalla sospensione cellulare, 106 cellule di
46 entrambe le linee sono immediatamente riseminate in p100 negli opportuni mezzi e le restanti cellule sono raccolte separatamente in pellet da 106 cellule.
Dopo 48h dalla seconda semina, il pellet cellulare subisce lo stesso trattamento di prima. L’estrazione dei miRNA dal pellet e dal mezzo è stata eseguita utilizzando miRNeasy mini kit (QIAGEN), seguendo il protocollo fornito dal produttore. L’estrazione dei miRNA viene effettuata su 2 pellet cellulari diversi raccolti nei due differenti giorni, sia per la linea A375 che per il clone 2.2.
I miRNA endogeni sono sottoposti a RNAseq utilizzando TruSeq Small RNA kit per generare una library di RNA e il sequenziatore HiSeq 2000 sequencer (Illumina). Date le piccole dimensioni dei miRNA è stata compiuta una lettura di 50bp in un'unica direzione. L’acquisizione delle sequenze è state eseguita allestendo 4 piste aspettandosi fino a 35 milioni letture (reads) per ciascun campione. I reads sono processati secondo gli steps indicati:
Rimozione della sequenza adattatrice (trim) dalla sequenza acquisita, per avere unicamente la sequenza del miRNA.
Creazione di un elenco di sequenze uniche e conteggio di ciascuna.
Creazione di un istogramma di distribuzione della taglia dei miRNA per verificare la bontà di lettura delle sequenze.
Estrazione da miRbase dell’ID corrispondente a ciascuna sequenza unica acquisita.
Vengono estratte solo le sequenze che corrispondono completamente.
Creazione della tabella con le reads di ciascun miRNA.
Normalizzazione del numero di reads dei miRNA. Brevemente, le counts di ciascun miRNA sono divise per la media geometrica di quel miRNA contro la libreria e la media di questo rapporto all’interno di ogni libreria da una dimensione della libreria stessa.
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L’analisi differenziale dell’espressione dei miRNA in coppie di campioni è stata effettuata tramite il software DEseq.
2.14 Trasformazione Batterica
Per effettuare i clonaggi vengono utilizzate le cellule di E. coli competenti DH5α. Le cellule vengono mantenute in ghiaccio e, una volte scongelate, si aggiunge il DNA plasmidico circolare, e si lasciano nel ghiaccio per 45 minuti. Trascorso questo tempo si sottopongono i batteri allo shock termico per 45 secondi a 42°C e poi ancora in ghiaccio per 2-3 minuti. A questo punto vengono aggiunti 500– 800μl di terreno L.B. e poi incubate a 37°C per 45 minuti, dopodichè si centrifugano i campioni a 6000 rpm per 10 minuti, si elimina il sovranatante e si piastrano i batteri su piastre di LB solido (1% triptone, 0.5% estratto di lievito, 1% NaCl, 1% agar, 100 μg/mL Ampicillina).