Introduzione alla parte sperimentale
20) e cristallografia a raggi X allo scopo di chiarire le interazioni stabilite a livello
molecolare tra questa classe di composti ed il sito catalitico di VEGFR-2. Si evidenzia che lo scaffold benzotiopiranopirimidinico è inserito nel sito attivo dell’enzima con l’azoto in posizione 3 e l’adiacente NH esociclico in posizione 2 che interagiscono mediante un doppio legame a idrogeno rispettivamente con i gruppi NH e CO del residuo Cys919, nella regione cerniera dell’enzima. Questo spiega perché i composti della serie I, che mancano dell’NH esociclico e che quindi stabiliscono un legame a idrogeno in meno, hanno un’attività inibitoria minore nei confronti dell’enzima. Lo scaffold benzotiopiranopirimidinico è inserito nella tasca idrofobica dell’ATP dove instaura interazioni idrofobiche con i residui Leu1035, Val899, Val916, Val848 e Leu840. L’estensione limitata di questa tasca non permette di ospitare sostituenti ingombranti in posizione 8 del cromoforo senza un riarrangiamento del ligando, e questo potrebbe portare alla perdita del doppio legame a idrogeno. Nel sito di legame, la Phe1047 è posizionata tra l’anello benzotiopiranico e l’anilina in posizione 2, stabilendo con essi interazioni a trasferimento di carica. L’anilina è orientata verso l’esterno dalla tasca di legame ed è stabilizzata da interazioni catione-π con la catena laterale del residuo Lys 838. Questa interazione spiega perché sostituenti diversi sull’anilina possono influenzare l’attività inibitoria di VEGFR: sostituenti elettron-donatori aumentano il potenziale elettrostatico dell’anello aromatico, favorendo l’interazione con trasferimento di carica; invece, l’inserimento sull’anello di sostituenti elettron-attrattori può indebolire l’interazione catione-π. Questo spiega perché composti sostituiti con Cl, F, Br e CF3 mostrano una bassa inibizione dell’enzima.[55]
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Figura 20. Legame tra il composto 1b e il sito attivo del recettore VEGFR2
Il ligando è rappresentato da bastoncini verdi, la proteina invece è arancione. I legami a idrogeno sono schematizzati da linee gialle tratteggiate. [52]
Il sostituente sull’anello aromatico dell’anilina è parzialmente esposto al solvente e questo può spiegare perché la sua sostituzione con un gruppo 2-benzilamminico determina una riduzione della capacità inibitoria di VEGFR-2. Il sostituente p- metossi del composto 1b[55] è rivolto verso il residuo di Asn923 e può stabilire quindi legami a idrogeno addizionali.
Questi studi hanno inoltre evidenziato la presenza di una carica positiva sul residuo di Lys868 del sito catalitico, suggerendo che modifiche nelle proprietà elettroniche dello scaffold benzotiopiranopirimidinico potevano rappresentare possibili opportunità per ottimizzare questo sistema.
Sulla base di questi risultati, è stata quindi progettata e sintetizzata una libreria di composti piridotiopiranopirimidinici (2-4) concepiti come azaisosteri dei derivati appena descritti (1), Figura 19.
L’introduzione di un atomo di azoto sul cromoforo della molecola poteva ragionevolmente produrre un effetto benefico nell’interazione con il sito dell’ATP che ospita il sistema eterociclico; inoltre, questo atomo di azoto poteva rappresentare un punto di ancoraggio addizionale all’enzima. In analogia con la classe delle benzotiopiranopirimidine I, tutti i prodotti studiati presentano una
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porzione arilica legata alla posizione 2 del sistema triciclico, direttamente o mediante uno spaziatore Z (NH, NHCH2).
La Tabella 1 riporta le attività dei composti delle serie 1, 2, 3 e 4 espresse come percentuale di inibizione dell’enzima tirosin-chinasico KDR. I composti sono stati testati ad una concentrazione di 7 µM. Semaxanib è stato utilizzato come composto di riferimento, per la sua elevata selettività nei confronti di VEGFR1 e VEGFR2, nonostante una modesta attività inibitoria.[54]
In generale, i derivati piridotiopiranici portanti una porzione anilinica in posizione 2 dell’anello triciclico (3) sono risultati i più attivi, in quanto, sia l’aggiunta di un gruppo metilenico (4), che l’eliminazione del gruppo spaziatore amminico (2), provocano una drastica riduzione dell’attività; questi dati evidenziano il ruolo cruciale della lunghezza della catena laterale.
Le due serie di composti (1a-j e a-j) mostrano un profilo di inibizione simile. In generale, i composti sostituiti con uno o più gruppi metossi mostrano la percentuale di inibizione più alta; mentre la sostituzione di questo gruppo con elementi elettron- attrattori, come Cl, Br o CF3, riduce notevolmente l’attività; l’atomo di F in R3
rappresenta invece un’eccezione.
Infine, in generale, la sostituzione in posizione 8 non è ben tollerata, probabilmente a causa della limitata estensione della zona del recettore che ospita lo scaffold eterociclico, che non consente la presenza di sostituenti voluminosi.
Tutti questi dati suggeriscono che le 2-anilino-piridotiopiranopirimidine interagiscono con KDR secondo un modello analogo a quello descritto per i deaza- analoghi benzo-tiopiranopirimidinici. Confrontando i dati di inibizione ottenuti per le serie 1a-j e 3a-i, si può osservare che la presenza di un atomo di azoto addizionale produce in generale un aumento della potenza inibitoria.
I derivati più attivi (3a, 3b, 3d, 3g, 3i, 3j) mostrano una percentuale di inibizione di KDR compresa tra 88 e 99.7 %. I valori di IC50 per i composti più attivi sono
compresi tra 0.016 e 0.56 µM, valori molto più alti rispetto al valore del Semaxanib, preso come composto di riferimento.
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Tabella 1. Attività inibitoria sull’enzima KDR dei derivati 1a-j, 2a-c, 3a-k, 4a- h e semaxanib come riferimento.
cpd Z R3 R4 R5 KDR(%) KDR IC50(M) 1a[55] NH H H H 54 8.2 1b[55] NH H OCH 3 H 67 2.7 1c[55] NH H Cl H <20 >50 1d[54] NH OCH 3 H H 75 0.97 1e[54] NH Cl H H <20 n.d. 1f[54] NH Br H H <20 n.d. 1g[54] NH F H H 52 n.d. 1h[54] NH CF 3 H H <20 n.d. 1i[54] NH OCH 3 OCH3 H 97 0.11 1j[54] NH OCH 3 OCH3 OCH3 81 0.27 2a - H H H 10 n.d. 2b - H OCH3 H 20 n.d. 2c - H Cl H 12 n.d. 3a NH H H H 88 0.56 3b NH H OCH3 H 91 0.52 3c NH H Cl H 62 n.d. 3d NH OCH3 H H 95.4 0.18 3e NH Cl H H 21 n.d. 3f NH Br H H 53 n.d. 3g NH F H H 99.7 0.092 3h NH CF3 H H 17 n.d. 3i NH OCH3 OCH3 H 94.8 0.19
3j NH OCH3 OCH3 OCH3 93.8 0.016
3k NCH3 H H H 2 n.d. 4a NHCH2 H H H 10 n.d. 4b NHCH2 H OCH3 H 38 n.d. 4c NHCH2 H Cl H 11 n.d. 4d NHCH2 OCH3 H H 17.7 n.d. 4e NHCH2 Cl H H 5.0 n.d. 4f NHCH2 Br H H 5.1 n.d. 4g NHCH2 OCH3 OCH3 H 16.7 n.d.
4h NHCH2 OCH3 OCH3 OCH3 11.2 n.d.
semaxanib - - - - 40 12.9
52
I risultati confermano l’importanza del gruppo metossi nell’attività.[54] Come già
abbiamo evidenziato per i composti della serie 1, sostituenti elettron-donatori sull’anilina pendente, come il gruppo metossi (composti 3b, 3d, 3i e 3j), determinano una più efficace inibizione dell’enzima, ragionevolmente aumentando il potenziale elettrostatico negativo dell’anello aromatico, e quindi permettendo di stabilire interazioni con trasferimento di carica più forti con la proteina target. Sostituenti elettron-attrattori in posizione meta risultano invece dannosi per l’attività inibitoria (composti 3e, 3f e 3h).
Studi di docking molecolari condotti sul composto 3j hanno evidenziato che lo scaffold triciclico è alloggiato nella tasca lipofila formata dai residui Leu840, Val 848, Ala866, Val899 e Leu1035, stabilendo con essi interazioni di Van der Waals (Figura 21a).
Uno dei due atomi di azoto del nucleo pirimidinico fuso e l’NH esociclico di 3j formano un doppio legame a idrogeno con i gruppi NH e CO del residuo Cys919 nella regione cerniera dell’enzima, a conferma della perdita di potenza dei composti che non presentano il gruppo NH come spaziatore Z.
Inoltre, si osservano interazioni con trasferimento di carica con residui di Phe918 e Phe1047. L’anello anilinico pendente è orientato verso l’esterno del sito attivo ed è stabilizzato da una interazione catione-π con la catena laterale caricata positivamente della Lys838.
Secondo questo studio (Figura 21b) una molecola di acqua posizionata tra il residuo Lys868 e l’atomo di azoto della piridina del sistema triciclico ha un’energia favorevole suggerendo la possibilità di un legame a idrogeno mediato dall’acqua. Questo fatto può spiegare l’aumento di potenza dei derivati piridotiopiranopirimidinici rispetto agli analoghi benzotiopiranopirimidinici che non hanno l’azoto piridinico e quindi non possono stabilire questo legame a idrogeno addizionale.[54]
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Figura 21. Legame della molecola 3j con il sito attivo del recettore VEGFR-2
Il ligando è rappresentato da bastoncini rosa mentre la proteina da bastoncini e nastri blu. I legami a idrogeno sono raffigurati da linee verdi tratteggiate.[54]
La presente tesi si inserisce in un progetto volto allo studio di diversi sistemi eteropoliciclici con lo scopo di individuare scaffold che, mediante opportune decorazioni, possano consentire lo sviluppo di nuovi inibitori di tirosin chinasi con potenziale terapeutico nell’ambito antitumorale.
Sono stati quindi sintetizzati una serie di derivati 2-fenilammino-chinazolonici di formula generale III (5a-g) e IV (6a-g), caratterizzati da un sistema benzopiranico; la progettazione si è realizzata mediante una classica strategia di Medicinal
Chemistry di semplificazione strutturale. Nello specifico, lo scaffold eterociclico è
stato semplificato, passando dal sistema triciclico delle classi I e II ad uno biciclico (fenil-ammino-chinazolinico) dei derivati III e IV; la porzione pirimidinica anilino- sostituita, ritenuta essenziale per l’interazione con la proteina target, è stata al contrario mantenuta. Successivamente, nella serie IV è stato inserito un secondo anello fenilico pendente alla posizione 7 del nucleo stesso, che potrebbe mimare l’anello aromatico benzofuso dei derivati I e II; lo scopo è quello di valutare come questa modifica strutturale influenzi l’attività inibitoria dei composti, nonché il loro effetto antiproliferativo.
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La procedura sintetica impiegata nella preparazione dei composti 5 a-g è descritta nello Schema 1.
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Schema 1
Condizioni di reazione e reagenti: i) DMF-DMA a 100°C/1h; ii) guanidina
cloridrato, etanolo assoluto, riflusso, overnight; iii) iodobenzene variamente sostituito, K2CO3, N,N’-DMEDA, CuI, in diossano anidro, 48 ore, 100°C.
Il primo step prevede la preparazione del composto 7[56] ottenuto dalla reazione tra i prodotti commerciali 1,3-cicloesandione e N,N-dimetilformammidedimetilacetale (DMF-DMA) per 1 ora a 100°C. Al termine della reazione, dopo raffreddamento, viene aggiunto etere etilico che porta alla formazione di un precipitato, che viene filtrato a pressione ridotta.
Il derivato 3-dimetilamminometilenico 7, così ottenuto, è risultato sufficientemente piro da poter essere utilizzato senza ulteriore purificazione: viene solubilizzato in etanolo assoluto a temperatura ambiente e alla miscela di reazione viene aggiunta guanidina cloridrato. La miscela ottenuta è scaldata a 100°C per tutta la notte, controllando l’andamento della reazione mediante TLC. Al termine, per raffreddamento dalla miscela di reazione precipita il composto 8, che viene filtrato a pressione ridotta ed utilizzato come tale nello step successivo.
Ad una soluzione di 8 in diossano anidro, sotto corrente di azoto, vengono addizionati: una quantità stechiometricamente doppia di iodobenzene opportunatamente sostituito, K2CO3 come base, N,N’-dimetilendiammina e CuI in
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l’andamento della reazione mediante TLC. Dopo raffreddamento, si aggiunge NH3
concentrata e una soluzione satura di NaCl e si estrae con diclorometano. Le fasi organiche riunite, vengono seccate su Na2SO4, ed evaporate a pressione ridotta. Si
ottiene un residuo oleoso grezzo (5a-g), che viene purificato mediante cromatografia flash utilizzando come miscela eluente etere di petrolio 40- 60°C/acetato di etile= 7:3.
La stessa procedura sintetica è stata utilizzata per la sintesi dei composti 6a-c (R = H, p-Cl, m-Cl), Schema 2.
Schema 2
Condizioni di reazione e reagenti: i) DMF-DMA a 100°C/1h; ii) guanidina
cloridrato, etanolo assoluto, riflusso, overnight; iii) iodobenzene variamente sostituito, K2CO3, N,N’-DMEDA, CuI in diossano anidro, 48 ore, 100°C.
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Al contrario, la reazione tra il derivato chinazolinico 10 e gli iodobenzeni sostituiti con uno o più gruppi metossilici (R = p-OCH3, m-OCH3, 3,4-OCH3, 3,4,5-OCH3),
nelle stesse condizioni di arilazione non ha mai fornito i prodotti 6d-g.
Sono stati fatti quindi numerosi tentativi variando le condizioni sperimentali di reazione (per esempio, arilazione del derivato chinazolinico 10 con gli iodobenzeni opportunamente sostituiti, ma utilizzando il t-Bu-OK anziché il K2CO3 come base)
ed anche applicando diverse procedure sintetiche (per esempio, reazione tra la metil-pseudourea e aniline opportunamente sostituite, per ottenere gli opportuni derivati guanidinici, da far reagire il dimetilen derivato 9). In tutti i casi le procedure usate non hanno dato i risultati sperati: talvolta sono stati recuperati i prodotti di partenza non reagiti, talvolta si è ottenuta una miscela di prodotti difficilmente purificabili ed identificabili.
I derivati 6d-g sono stati quindi ottenuti con la procedura sintetica descritta nello
Schema 3.[57]
Il primo step prevede la sintesi dei derivati guanidinici 11a-d, a partire dalle corrispondenti aniline commerciali. L’anilina appropriatamente sostituita è stata solubilizzata in etanolo sotto agitazione a 0°C, addizionata di acido nitrico concentrato goccia a goccia fino a pH acido e successivamente di una quantità stechiometricamente equivalente di cianammide, solubilizzata nella minima quantità di acqua. La miscela di reazione è scaldata a riflusso (100°C) per circa cinque ore, monitorando l’andamento della reazione mediante TLC. Al termine della reazione, si diluisce con etanolo (50 mL), si lascia raffreddare, e si ottiene un precipitato costituito dalle guanidine 11a-d grezze, che vengono purificate mediante cristallizzazione da etanolo.
Il secondo step prevede la reazione tra il dimetilen derivato 9 e una quantità in eccesso stechiometrico delle guanidine 11a-d, in soluzione etanolica fortemente basica. Ad una soluzione di etossido di sodio in etanolo (preparato in situ addizionando Na metallico all’etanolo), si addiziona l’opportuno derivato guanidinico 11a-d e si lascia solubilizzare a temperatura ambiente; quindi si aggiunge il dimetilen derivato 9 e si scalda a 100°C per circa cinque ore, controllando l’andamento della reazione mediante TLC. Al termine, la miscela di
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6d-g grezzi, che vengono purificati mediante cromatografia flash (miscela eluente
etere di petrolio 40-60°C/acetato di etile = 6:4).
Schema 3
Condizioni di reazione e reagenti: i) EtOH a 100°C/5h; ii) EtONa a 100 °C/5h.
Tutti i composti ottenuti sono stati caratterizzati con dati fisici e spettroscopici (1H- NMR e 13C-NMR), che sono risultati in accordo con le strutture proposte.
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Parte
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Materiali e metodi
Se non diversamente specificato, tutti i solventi ed i reagenti utilizzati per la sintesi sono stati acquistati dalle ditte fornitrici e sono stati utilizzati senza ulteriore purificazione.
Come agente essiccante è stata utilizzata P2O5.
L’evaporazione dei solventi è stata effettuata sottovuoto utilizzando l’evaporatore rotante (rotavapor).
Le rese (%) si riferiscono a composti cromatograficamente e spettroscopicamente (1H-NMR) omogenei.
Le reazioni sono state monitorate mediante cromatografia su strato sottile (T.L.C.) realizzate su foglio di alluminio ricoperto di silice (MERK 60 F-254, spessore 0.2 mm.
Per le colonne cromatografiche è stato utilizzato il gel di silice 60 (230-400 mesh). Gli spettri di risonanza magnetica del protone (1H-NMR) e del carbonio (13C-NMR)
sono stati eseguiti in soluzione di cloroformio deuterato (CDCl3), oppure in una
soluzione di dimetilsolfossido esa-deuterato (DMSO-d6) con uno spettrometro
Bruker AVANCE 400 (400-MHz).
I punti di fusione sono stati determinati con un apparecchio di Reichert Kӧfler e non sono stati corretti.
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2-[(dimetilammino)metilen]-1,3-cicloesandione (7)[53]
Una miscela di 1,3-cicloesandione (2.00 g, 18.0 mmoli) e DMF-DMA (3.98 mL, 30.0 mmoli) viene scaldata a 100 °C per un’ora (TLC: etere di petrolio 40-60
oC/AcOEt = 1:9). Dopo raffreddamento alla soluzione viene addizionato etere
etilico e, dopo triturazione, si ottiene un precipitato arancione che viene filtrato a pressione ridotta. Si ottengono 2.576 g di prodotto desiderato 7.
Resa: 84 %; P.f.: 110-112 °C.
2-ammino-7,8-diidro-5(6H)-chinazolone (8)[58]
Ad una soluzione di 2.576 g del derivato 7 (15.0 mmoli) in etanolo assoluto vengono addizionati 1.43 g di guanidina cloridrato (15.0 mmoli). La miscela risultante viene fatta refluire per 16 ore a 100 °C (TLC: Etere di petrolio 40-60
oC/AcOEt = 1:9). Dopo raffreddamento si ottiene un precipitato giallo pallido che
viene filtrato a pressione ridotta ottenendo 0.795 g di composto 8 che viene ricristallizzato da etanolo.
Resa: 53 %; P.f.: 268-270 °C.
Procedura generale per la sintesi dei derivati 2-(fenilammino)-7,8- diidrochinazolin-5-(6H)-onici (5a-g)
Ad una soluzione di 0.500 g di derivato 8 in diossano, sotto corrente di azoto, vengono aggiunti 0.585 g di CuI (3.07 mmoli), 0.847 g di K2CO3 (6.14 mmoli),
0.33 mL di DMEDA (3.07 mmoli) e l’opportuno iodobenzene (6.14 mmoli). La miscela viene scaldata a 100 °C per 48 ore (TLC: Etere di petrolio 40-60 oC/AcOEt
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concentrata ed una soluzione satura di NaCl e si effettuano successive estrazioni con diclorometano. Le fasi organiche vengono riunite, seccate su Na2SO4, e, dopo
filtrazione, evaporate a pressione ridotta. Il residuo ottenuto, costituito dai prodotti
5a-g grezzi, viene purificato mediante cromatografia flash su gel di silice (miscela
eluente: etere di petrolio 40-60 °C/AcOEt = 7:3).
7,8-diidro-2-(fenilammino)chinazolin-5(6H)-one (5a) Resa: 59 %; P.f.: 167-169 °C; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6, ppm): 10.30 (s, 1H), 8.81 (s, 1H), 7.80 (d, 2H, J = 8.0 Hz), 7.35-7.31 (m, 2H), 7.07-7.03 (m, 1H), 2.91 (t, 2H, J = 6.2 Hz), 2.57 (t, 2H, J = 6.4 Hz), 2.06 (m, 2H). 2-(4-metossifenilammino)-7,8-diidrochinazolin-5(6H)-one (5b) Resa: 66 %; P.f.: 157-159 °C; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6, ppm): 10.14 (s, 1H), 8.76 (s, 1H), 7.66-7.64 (m, 2H), 6.92 (d, 2H, J = 9.2 Hz), 3.74 (s, 3H), 2.86 (t, 2H, J = 6.0 Hz), 2.54 (t, 2H, J = 6.0 Hz), 2.06-2.03 (m, 2H). 2-(3-metossifenilammino)-7,8-diidrochinazolin-5(6H)-one (5c) Resa: 32 %; P.f.: 126-128 °C; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6, ppm): 10.27 (s, 1H), 8.82 (s, 1H), 7.55 (s, 1H), 7.36 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 7.23 (t, 1H, J = 8.0 Hz), 6.63 (d, 1H, J = 7.6 Hz), 3.75 (s, 3H), 2.91 (t, 2H, J = 6.0 Hz), 2.57 (t, 2H, J = 6.2 Hz), 2.08-2.05 (m, 1H); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6, ppm): 195.47, 173.92, 160.88, 159.55, 158.18, 140.95, 129.81, 118.55, 112.77, 108.44, 106.40, 55.43, 38.17, 31.99, 21.24. 2-(4-clorofenilammino)-7,8-diidrochinazolin-5(6H)-one (5d) Resa: 25 %; P.f.: 217-219 °C; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6, ppm): 10.43 (s, 1H), 8.82 (s, 1H), 7.84 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 7.39 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 2.91 (t, 2H, J = 6.2 Hz), 2.57 (t, 2H, J = 6.4 Hz), 2.10-2.00 (m, 2H).
63 2-(3-clorofenilammino)-7,8-diidrochinazolin-5(6H)-one (5e) Resa: 44 %; P.f.: 215-217 °C; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6, ppm): 8.85 (s, 1H), 8.00-7.98 (m, 1H), 7.75 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 7.36 (t, 1H, J = 8.2 Hz), 7.11-7.08 (m, 1H), 2.93 (t, 2H, J = 6.2 Hz), 2.58 (t, 2H, J = 6.6 Hz), 2.11-2.00 (m, 2H); 13CNMR (100 MHz, DMSO-d6, ppm): 195.52, 174.04, 160.70, 158.22, 141.40, 133.46, 130.73, 122.73, 119.48, 118.99, 118.62, 38.17, 31.94, 21.19. 2-(3,4-metossifenilammino)-7,8-diidrochinazolin-5(6H)-one (5f) Resa: 39 %; P.f: 153-157 °C; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6, ppm): 10.13 (s, 1H), 8.77 (s, 1H), 7.54 (bs, 1H), 7.28 (dd, 1H, Jmax = 8.4 Hz, Jmin = 2.4 Hz), 6.92 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 3.75 (s, 3H), 3.74 (s, 3H), 2.88 (t, 2H, J = 6.0 Hz), 2.55 (t, 2H, J = 6.4 Hz), 2.08-2.02 (m, 2H); 13CNMR (100 MHz, DMSO-d6, ppm): 195.34, 173.86, 160.85, 158.22, 148.97, 145.28, 133.21, 118.11, 112.58, 106.06, 56.27, 55.88, 38.16, 32.03, 21.28. 2-(3,4,5-metossifenilammino)-7,8-diidrochinazolin-5(6H)-one (5g) Resa: 20 %; P.f: 177-181 °C; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6, ppm): 10.17 (s, 1H), 8.80 (s, 1H), 7.26 (s, 2H), 3.77 (s, 6H), 3.64 (s, 3H), 2.91 (t, 2H, J = 6.0 Hz), 2.56 (t, 2H, J = 6.6 Hz), 2.10-2.03 (m, 2H); 13CNMR (100 MHz, DMSO-d6, ppm): 195.40, 173.83, 160.77, 158.16, 153.75, 153.09, 145.62, 135.81, 135.71, 133.73, 118.38, 60.59, 55.82, 38.16, 32.04, 21.25 2-((dimetilamino)metilene)-5-fenilcicloesan-1,3-dione (9)
Una miscela di 5-fenil-1,3-cicloesandione (2.00 g, 10.0 mmoli) e DMF-DMA (2.25 mL, 17.0 mmoli) viene scaldata a 100 °C per un’ora (TLC: etere di petrolio 40-60
64
etilico e dopo triturazione si ottiene un precipitato arancione che viene filtrato a pressione ridotta. Si ottengono 2.330 g di prodotto desiderato 9.
Resa: 96 %; P.f: 138-140 °C; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d
6, ppm): 8.045 (s,1H),
7.32 (d, 4H, J = 4.4 Hz), 7.24-7.21 (m, 1H), 3.43 (s, 3H), 3.34-3.25 (m, 2H), 3.10 (s, 3H), 2.74-2.62 (m, 2H), 2.47 (d, 1H, J = 4.4 Hz).
2-amino-7,8-diidro-7-fenilchinazolin-5(6H)-one (10)[58]
Ad una soluzione di 1.500 g del derivato 9 (6.17 mmoli) in etanolo assoluto vengono addizionati 0.589 g di guanidina cloridrato (6.17 mmoli). La miscela risultante viene fatta refluire per 16 ore a 100 °C (TLC: etere di petrolio 40-60
oC/AcOEt = 1:9). Dopo raffreddamento si ottiene un precipitato giallo che viene
filtrato a pressione ridotta ottenendo 0.884 g di composto 10 che viene ricristallizzato da etanolo.
Resa: 48 %; p.f.: 223-226 °C; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6, ppm): 8.67 (s, 1H),
7.64-7.61 (m, 2H), 7.38-7.31 (m, 4H), 7.27-7.23 (m, 1H), 3.51-3.43 (m, 1H), 3.19- 3.09 (m, 1H), 2.94-2.85 (m, 2H), 2.65-2.51 (m, 1H).
Procedura generale per la sintesi dei derivati 7,8-diidro-7-fenil-2- (fenilammino)chinazolin-5(6H)-onici (6a-c)
Ad una soluzione di 0.500 g di derivato 10 (2.1 mmoli) in diossano, sotto corrente di azoto, vengono aggiunti 0.400 g di CuI (2.1 mmoli), 0.580 g di K2CO3 (4.2
mmoli), 0.23 mL di DMEDA (2.1 mmoli) e l’opportuno iodobenzene (4.2 mmoli). La miscela viene scaldata a 100 °C per 48 ore (TLC: etere di petrolio 40-60
oC/AcOEt = 7:3). Dopo raffreddamento alla miscela ottenuta viene addizionata NH 3
65
concentrata ed una soluzione satura di NaCl e si effettuano successive estrazioni con diclorometano. Le fasi organiche vengono riunite, seccate su Na2SO4, e, dopo
filtrazione, evaporate a pressione ridotta. Il residuo ottenuto, costituito dai prodotti
6a-c grezzi, viene purificato mediante cromatografia flash su gel di silice (miscela
eluente: etere di petrolio 40-60 °C/AcOEt = 7:3).
7,8-diidro-7-phenyl-2-(phenylamino)quinazolin-5(6H)-one (6a) Resa: 35 %; P.f: 172-174 °C; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6, ppm): 10.37 (s, 1H), 8.87 (s, 1H), 7.81 (d, 2H, J = 8.0 Hz), 7.41-7.27 (m, 8Hz), 7.05 (t, 1H, J = 7.4Hz), 3.59-3.52 (m, 1H), 3.30-3.27 (m; 1H), 3.07-2.95 (m; 2H), 2.73-2.68 (m; 1H). 2-(4-clorofenilamino)-7,8-diidro-7-fenilchinazolin-5(6H)-one (6b) Resa: 20 %; P.f: 171-174 °C; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6, ppm): 10.53 (s,1H), 8.88 (s, 1H), 7.86 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 7.40-7.35 (m, 1H), 7.29-7.25 (m, 1H), 3.60- 3.57 (m, 1H), 3.07-2.96 (m, 2H), 2.73-2.69 (m, 1H), 1.28-1.08 (m, 1H), 0.88-0.85 (m, 1H). 2-(3-clorofenilamino)-7,8-diidro-7-fenilchinazolin-5(6H)-one (6c) Resa: 20 %; P.f: 146-148 °C; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6, ppm): 10.56 (s, 1H), 8.91 (s, 1H), 8.00 (s, 1H), 7.76 (d, 1H, J=7.2 Hz), 7.42-7.27 (m; 6H), 7.10 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 3.58-3.29 (m, 1H), 3.08-2.97 (m, 2H), 2.75-2.51 (m, 2H).
Procedura generale per la sintesi delle fenil-guanidine (11a-d)[57]
L’appropriata anilina (9.98 mmoli) viene solubilizzata in 6.0 mL di etanolo sotto agitazione a 0 °C, quindi si addizionano, goccia a goccia, 0.90 mL di HNO3
concentrato (28.28 mmoli), 0.460 g di cianammide (9.98 mmoil), precedentemente solubilizzata nella minima quantità di acqua (0.90 mL) e si scalda a riflusso (100
66
°C) per 5 ore (analisi TLC: etere di petrolio 40-60 oC/AcOEt = 7:3). Dopo raffreddamento la sospensione ottenuta viene filtrata sottovuoto ed il solido raccolto costituito dalle guanidine nitrato 11a-d grezze viene purificato mediante cristallizzazione da etanolo.
(4-metossifenil)guanidina (11a [59]
Resa: 65 %; P.f: 142-144 °C; la struttura è stata confermata con lo spettro H1 NMR riportato in letteratura.[59] (3-metossifenil)guanidina (11b) Resa: 56 %; P.f: 152-154 °C; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6, ppm): 9.59 (s, 1H), 7.38-7.33 (m, 5H), 6.89-6.87 (m, 1H), 6.82-6.80 (m, 2H), 3.78 (s, 3H). (3,4-dimetossifenil)guanidina (11c) Resa: 70 %; P.f: 136-139 °C. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6, ppm): 9.34 (s, 1H), 7.17 (s, 4H), 7.01 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 6.85 (d, 1H, J = 2.8 Hz), 6.78 (dd, 1H, Jmax=8.8 Hz, Jmin=2.4 Hz), 3.78 (s, 3H), 3.77 (s, 3H). (3,4,5-trimetossifenil)guanidina (11d) Resa: 53 %; P.f: 200-202 °C. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6, ppm): 9.46 (s,1H), 7.28 (s, 4H), 6.56 (s, 2H), 3.79 (s, 6H), 3.67 (s, 3H).
Procedura generale per la sintesi dei derivati 7,8-diidro-7-fenil-2- (fenilammino)chinazolin-5(6H)-onici (6d-g)
0.055 g (2.4 mmoli) di sodio vengono solubilizzati, sotto corrente di azoto anidro, in 8.00 mL di EtOH assoluto, ed alla soluzione ottenuta vengono addizionate 1.6 mmol dell’appropriata guanidina nitrato 11a-d e si lascia a temperatura ambiente sotto agitazione, fino a completa solubilizzazione della guanidina (circa 20 minuti).
67
Successivamente si addizionano 0.200 g (0.8 mmol) di dimetilen derivato 9 e si scalda a riflusso (100 °C) per 24 ore (TLC: etere di petrolio 40-60 oC/AcOEt = 7:3). Dopo raffreddamento la miscela risultante viene evaporata a pressione ridotta ed il residuo ottenuto, costituito dai corrispondenti derivati 6d-g grezzi, viene purificato mediante cromatografia flash su gel di silice (miscela eluente: etere di petrolio 40- 60 °C/AcOEt = 7:3) e successivamente è cristallizzato in EtOH.
2-(4-metossifenilamino)-7,8-diidro-7-fenilchinazolin-5(6H)-one (6d) Resa: 20 %; P.f: 159-162 °C; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6, ppm): 10.23 (s, 1H), 8.82 (s, 1H), 7.68 (bs, 2H), 7.41-7.34 (m, 4H), 7.28-7.26 (m, 1H), 6.92 (d, 2H, J = 9.20 Hz), 3.74 (s, 3H), 3.55-3.51 (m, 1H), 3.30-3.22 (m, 1H), 3.02-2.93 (m, 2H), 2.71-2.66 (m, 1H). 2-(3-metossifenilamino)-7,8-diidro-7-fenilchinazolin-5(6H)-one (6e) Resa: 25 %; P.f: 178-180°C; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6, ppm): 10.34 (s, 1H), 8.86 (s, 1H), 7.54 (s, 1H), 7.40-7.34 (m, 5H), 7.27-7.20 (m, 2H), 6.63 (dd, 1H, Jmax = 8.0 Hz, Jmin = 2.0 Hz), 3.74 (s, 3H), 3.58-3.52 (m, 1H), 3.30-3.26 (m, 2H), 3.06- 2.94 (m, 2H), 2.72-2.67 (m, 1H). 2-(3,4-dimetossifenilamino)-7,8-diidro-7-fenilchinazolin-5(6H)-one (6f) Resa: 20 %; P.f: 218-220 °C; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6, ppm): 10.20 (s, 1H), 8.82 (s, 1H), 7.39-7.33 (m, 4H), 7.30-7.24 (m, 2H), 6.90 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 3.73 (s, 3H), 3.72 (s, 3H), 3.54-3.50 (m, 1H), 3.29-3.22 (m, 1H), 3.02-2.91 (m, 2H), 2.67 (dd, Jmin = 2.4 Hz, Jmax = 8.4 Hz, 1H); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6, ppm):
194.23, 172.70, 160.68, 157.81, 148.57, 144.92, 143.40, 132.75, 128.67, 127.01, 126.80, 117.21, 112.15, 55.85, 55.50, 44.78, 38.30.
68 2-(3,4,5-trimetossifenilamino)-7,8-diidro-7-fenilchinazolin-5(6H)-one (6g) Resa: 20 %; P.f: 166-168 °C; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6, ppm): 10.25 (s, 1H), 8.86 (s, 1H), 7.41-7.37 (m, 4H), 7.35-7.28 (m, 3H), 3.76 (s, 6H), 3.63 (s, 3H), 3.58- 3.53 (m, 1H), 3.31-3.27 (m, 1H), 3.06-2.95 (m, 2H), 2.71-2.67 (m, 1H); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6, ppm): 194.31, 172.56, 168.79, 160.66, 157.78, 152.71, 143.39, 142.66, 135.34, 133.35, 128.69, 127.05, 126.82, 60.19, 55.82, 44.82, 38.34.
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