Cxcl3 contrasta il difetto di migrazione dei GCPs e riduce l’area delle lesioni 90

Per studiare le implicazioni funzionali della down-regolazione di Cxcl3, abbiamo testato la capacità di questa chemochina di revertire il difetto di migrazione dei GCPs negli animali

Tis21-null: a tal fine, abbiamo trattato per 5 giorni colture organotipiche cerebellari di topi a

P7 sia Tis21KO _{che Ptch1}+/−_/Tis21KO _{con la proteina ricombinante Cxcl3. Abbiamo osservato}

che la chemochina può significativamente contrastare il difetto di migrazione cellulare, come indicato dalla percentuale di GCPs BrdU+ migrati all’esterno dell’EGL (Figura 8.12A e B; Cxcl3 vs veicolo: in Tis21KO _{p = 0.001; in Ptch1}+/−_/Tis21KO _{p < 0.0001). In particolare, nei}

topi Ptch1+/−_/Tis21KO _{Cxcl3 ha dimostrato di indurre la migrazione del 75% circa dei GCPs,}

permettendo quasi il raggiungimento del livello basale di migrazione osservato nei topi wild type (Figura 8.10B). Al contrario, il trattamento con Cxcl3 ha dimostrato di non influenzare il tasso di proliferazione e differenziamento dei GCPs dell’EGL: nessuna significativa differenza rispetto ai controlli non trattati è stata, infatti, riscontrata nel numero di cellule BrdU+ _{(dopo un pulse di 2 ore), NeuroD1}+ _{e NeuN}+ _{in colture organotipiche cerebellari di topi}

a P7 dei 4 genotipi in esame esposte alla proteina Cxcl3 per 48 ore (Figura 8.12C).

Successivamente, abbiamo verificato se l’effetto positivo di Cxcl3 sulla migrazione dei GCPs fosse o meno indipendente dal contesto tessutale. A tale scopo, abbiamo silenziato il gene Cxcl3 in preparati di GCPs purificati da ratti wild type a P7 mediante trasfezione di due specifici siRNA interagenti con l’mRNA di Cxcl3, siRNA7-Cxcl3 e siRNA6-Cxcl3. Questi siRNA sono stati selezionati tra diverse sequenze candidate di 19 nucleotidi disegnate dal software MWG Design Tool (MWG) come sequenze capaci di ridurre i livelli dell’mRNA di

Cxcl3 rispetto a GCPs trasfettati con un siRNA di controllo diretto contro il gene della

luciferasi (Figura 8.12D, destra; siRNA7-Cxcl3 vs siRNA di controllo p = 0.0001; siRNA6-

Cxcl3 vs siRNA di controllo p = 0.002). Un numero significativamente più basso di GCPs

trasfettati sia con il siRNA7-Cxcl3 che con il siRNA6-Cxcl3 ha dimostrato di poter migrare nella parte inferiore di una camera di Boyden modificata, confrontati con GCPs trasfettati con il siRNA di controllo (Figura 8.12D, sinistra; siRNA7-Cxcl3 vs siRNA di controllo p = 0.002; siRNA6-Cxcl3 vs siRNA di controllo p = 0.006). Una parallela analisi dello stato di differenziamento delle preparazioni dei GCPs, sia silenziati per Cxcl3 che per il gene della luciferasi, non ha mostrato differenze nella percentuale di espressione di NeuN (63.8 ± 2.2 per la trasfezione con il siRNA7-Cxcl3, 61.9 ± 1.1 per quella con il siRNA6-Cxcl3 e 62.9 ± 3.2 per quella con il siRNA di controllo; i dati sono il risultato di 3 esperimenti indipendenti).

Figura 8.12 Cxcl3 reverte il difetto di migrazione dei GCPs fuori dall’EGL o dalle lesioni e riduce l’area delle iperplasie in topi Ptch1+/−/Tis21KO. A. Immagini rappresentative ottenute al microscopio confocale di colture organotipiche cerebellari di topi a P7 Tis21KO e Ptch1+/−/Tis21KO trattate o meno con Cxcl3, mostranti i GCPs BrdU+ _{all’interno ed all’esterno dell’EGL (indicato con una linea bianca tratteggiata). Barra 100 μm. B.}

Percentuale di cellule BrdU+ _{localizzate fuori dall’EGL rispetto al numero totale di cellule BrdU-marcate; i dati}

sono presentati come media±SEM di tre esperimenti indipendenti (3 topi per ciascun genotipo sono stati analizzati). C. Percentuale di GCPs BrdU+_{, NeuroD1}+ _{e NeuN}+ _{rispetto al numero totale di cellule dell’EGL}

dopo trattamento o meno con Cxcl3; i dati sono presentati come media±SEM di tre esperimenti indipendenti (3 topi per ciascun genotipo sono stati analizzati). D. (sinistra) Test con una camera di Boyden modificata della capacità migratoria dei GCPs purificati da cervelletti di ratti wild type a P7 trasfettati con siRNA7-Cxcl3, siRNA6-Cxcl3 o con un siRNA di controllo. I dati sono presentati come numero medio di cellule per campo ± SEM di tre esperimenti indipendenti, contando 20 campi per pozzetto (almeno 2 pozzetti per esperimento).

(destra) Media±SEM del livello di espressione dell’mRNA di Cxcl3 nei GCPs silenziati per il test di migrazione

rispetto al livello nei GCPs trasfettati con il siRNA di controllo (scelto come unità). TBP è stato usato per normalizzare i dati. E. Immagini rappresentative ottenute al microscopio confocale di iperplasie diffuse in organotipiche cerebellari di topi a P30 Ptch1+/−/Tis21KO/GFP trattate o meno con Cxcl3, mostranti i GCPs GFP+

all’interno delle lesioni e, a maggiore ingrandimento, i GCPs BrdU+ _{migrati fuori dalle lesioni (indicate con una}

linea bianca tratteggiata). Barre 500 μm e 100 μm, rispettivamente. F-G. Area delle lesioni (F) e percentuale di GCPs BrdU+ _{migrati fuori dalle lesioni (G) in organotipiche cerebellari di topi a P30 Ptch1}+/−_/Tis21KO_/GFP

trattate o meno con Cxcl3; i dati sono presentati come media±SEM di tre esperimenti indipendenti. ** p < 0.01 e *** p < 0.001, test del t di Student.

Analogamente, colture organotipiche cerebellari di topi wild type a P7 trasfettate con il siRNA6-Cxcl3 hanno mostrato un numero più basso di GCPs migrati fuori dall’EGL rispetto ai GCPs trasfettati con il siRNA di controllo (Figura 8.13). Quindi, questi dati indicano che Cxcl3 svolge un ruolo tessuto-indipendente nella migrazione dei GCPs fuori dall’EGL.

Figura 8.13 Il silenziamento di Cxcl3 nei GCPs conduce all’inibizione della loro capacità migratoria fuori dall’EGL. A. Immagini rappresentative ottenute al microscopio confocale di colture organotipiche cerebellari di topi wild type a P7 mostranti i GCPs BrdU+_{, silenziati o meno per l’espressione di Cxcl3, all’interno ed}

all’esterno dell’EGL (indicato con una linea bianca tratteggiata). Barra 100 μm. B. Percentuale di cellule BrdU+_,

silenziate o meno per l’espressione di Cxcl3, localizzate fuori dall’EGL rispetto al numero totale di cellule BrdU-marcate. I dati sono presentati come media±SEM di tre esperimenti indipendenti. C. Media±SEM del livello di espressione dell’mRNA di Cxcl3 nelle organotipiche cerebellari trasfettate per il test di migrazione rispetto al livello in quelle trattate con il siRNA di controllo (scelto come unità). TBP è stato usato per normalizzare i dati. * p < 0.05 e *** p < 0.001, test del t di Student.

Infine, abbiamo analizzato l’effetto della chemochina Cxcl3 sui GCPs preneoplastici contenuti all’interno delle lesioni. Abbiamo osservato che in colture organotipiche di topi

Ptch1+/−_/Tis21KO_{/GFP a P30 5 giorni di trattamento con Cxcl3 hanno contrastato}

significativamente il difetto di migrazione dei pGCPs all’esterno delle lesioni (Figura 8.12E e G; Cxcl3 vs veicolo p = 0.0006); conseguentemente, il trattamento con Cxcl3 ha ridotto

significativamente l’area delle iperplasie (Figura 8.12E e F; Cxcl3 giorno 0 vs giorno 5

p = 0.003). Questi risultati indicano che l’addizione della chemochina Cxcl3 esogena può

efficacemente correggere il difetto di migrazione Tis21-dipendente dei GCPs in fase preneoplastica e, di conseguenza, ridurre l’area delle lesioni.

8.5 TIS21 È RECLUTATO SUL PROMOTORE DI CXCL3 ED INDUCE LA SUA