Immunoistochimica 59

7.2.1 Preparazione dei campioni

I cervelli dei topi a P7 ed a P14 sono stati dissezionati e fissati over night a 4°C per semplice immersione in una soluzione di PFA al 4% in PBS-DEPC. Al contrario, i cervelli dei topi a P42 ed a P84 sono stati dissezionati dopo perfusione transcardiaca con una soluzione di PFA al 4% in PBS-DEPC e fissati over night a 4°C sempre in PFA al 4% in PBS-DEPC. In entrambi i casi, i cervelli sono stati successivamente equilibrati in PSB-DEPC contenente il 30% di saccarosio per 24 ore a 4°C e quindi criopreservati a −80°C.

L’immunoistochimica è stata eseguita su sezioni seriali di cervelletto dello spessore di 20 μm (per l’analisi dell’EGL) o di 40 μm (per lo studio delle lesioni), tagliate sagittalmente a −25°C al criostato da cervelli incorporati nel Tissue-Tek OCT, una resina che conferisce al

tessuto la rigidità sufficiente per il taglio. Le sezioni, riposte su vetrino (20 μm) o flottanti (40 μm), sono state processate al fine di localizzare specifici marcatori cellulari attraverso l’interazione antigene-anticorpo.

7.2.2 Marcatura con BrdU, anticorpi primari e secondari

L’analisi immunoistochimica delle sezioni, trattate con metodi fluorescenti per visualizzare l’incorporazione della BrdU e diversi altri markers cellulari, è stata ottenuta attraverso il protocollo sperimentale riportato di seguito.

• Smascheramento antigenico. Al fine di favorire il rilevamento della BrdU incorporata e permettere il suo successivo legame all’anticorpo primario, le sezioni sono state sottoposte a denaturazione del DNA mediante trattamento con HCl 2 N per 45 minuti a 37°C, seguito da lavaggi con sodio borato 0.1 M pH 8.5 per 10 minuti a temperatura ambiente.

• Incubazione per 1 ora a 4°C con TBS Plus (10 mM Tris HCl pH 8.0; 150 mM NaCl; 0.1% Triton X-100; 0.01% Tween 20) + siero normale al 3%. Questo passaggio permette di bloccare i siti aspecifici, poiché la soluzione cross-reagisce con le immunoglobuline dell’animale in cui è stato sviluppato l’anticorpo secondario.

• Incubazione per tutta la notte a 4°C con gli anticorpi primari opportunamente diluiti in TBS Plus + siero normale al 3%. Per la realizzazione di questo studio sono stati utilizzati numerosi anticorpi cross-reattivi con specifici antigeni murini:

à anti-BrdU (MCA2060; AbD Serotec, Raleigh, NC, USA); monoclonale prodotto in ratto; diluizione 1:150.

à anti-Caspasi-3 attivata (#9661; Cell Signaling Technology Inc., Danvers, MA, USA); policlonale prodotto in coniglio; diluizione 1:100.

à anti-NeuroD1 (AF2746; R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA); policlonale prodotto in capra; diluizione 1:100.

à anti-NeuN (MAB377; Millipore Bioscience Research Reagents, Temecula, CA, USA); monoclonale prodotto in topo; diluizione 1:100.

à anti-GFAP (sc-6170; Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, USA); policlonale prodotto in capra; diluizione 1:300.

à anti-Cxcr2 (sc-682; Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, USA); policlonale prodotto in coniglio; diluizione 1:200.

• Incubazione per 35 minuti a temperatura ambiente con gli anticorpi secondari diluiti 1:200 in TBS. In questo studio sono stati impiegati i seguenti anticorpi secondari (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA):

à DARAT-TRITC (tetrametil-rodamina isotiocianato coniugato ad IgG di asino anti- ratto), utilizzato per rilevare l’anticorpo anti-BrdU.

à DAR-TRITC (tetrametil-rodamina isotiocianato coniugato ad IgG di asino anti- coniglio), utilizzato per rilevare l’anticorpo anti-Caspasi-3 attivata.

à DAG-Cy3 (indocarbocianina Cy3 coniugata ad IgG di asino anti-capra), utilizzato per rivelare l’anticorpo anti-NeuroD1.

à DAM-Cy2 (cianina Cy2 coniugata ad IgG di asino anti-topo), utilizzato per rilevare l’anticorpo anti-NeuN.

à DAG-Cy2 (cianina Cy2 coniugata ad IgG di asino anti-capra), utilizzato per rilevare l’anticorpo anti-GFAP.

à DAR-Cy2 (cianina Cy2 coniugata ad IgG di asino anti-coniglio), utilizzato per rilevare l’anticorpo anti-Cxcr2.

• Colorazione delle sezioni con Hoechst 33258 (1 mg/ml in PBS). • Montaggio dei vetrini e chiusura con glicerolo/PBS 3:1.

7.2.3 Analisi delle immagini

Le immagini delle sezioni sottoposte ad immunofluorescenza sono state ottenute mediante l’uso di un microscopio confocale a scansione laser TCS SP5 (Leica Microsystems, Wetzlar, Germania), in modalità di scansione sequenziale al fine di escludere una cross-reattività tra i canali. Tutte le acquisizioni sono state successivamente esaminate tramite il software per analisi di immagini I.A.S. (Delta Sistemi, Roma, Italia).

7.2.4 Quantificazione del numero di cellule nell’EGL e nelle lesioni

La quantificazione delle cellule proliferanti, differenzianti o apoptotiche nell’EGL è stata eseguita su sezioni sagittali non adiacenti a metà del quinto, del settimo e del nono folia, analizzando cinque sezioni per animale e tre animali per genotipo. Il numero di cellule è stato espresso come rapporto percentuale tra le cellule proliferanti (BrdU+), differenzianti (NeuroD1+ o NeuN+) o apoptotiche (Caspasi-3+ attivata) ed il numero di cellule totali (marcate con Hoechst 33258), contate per l’intera lunghezza dell’EGL in ciascun campo microfotografico digitale.

La quantificazione delle cellule proliferanti, differenzianti o apoptotiche nelle lesioni preneoplastiche è stata eseguita su almeno cinque sezioni sagittali non adiacenti per lesione, contando le cellule positive per i diversi marcatori nell’intera area preneoplastica, definita dalla presenza di cellule GFP+. Il numero di cellule, quindi, è stato espresso come cellule

proliferanti (BrdU+), differenzianti (NeuroD1+ o NeuN+) o apoptotiche (Caspasi-3+ attivata) per millimetro quadrato di lesione. Sono state esaminate tutte le lesioni preneoplastiche presenti in ciascun animale analizzato, il cui numero per genotipo e per età è riportato in Figura 8.2E.

7.2.5 Saggi di migrazione cellulare, area e volumi delle lesioni

Negli esperimenti condotti per saggiare la migrazione dall’EGL, il numero di cellule marcate per BrdU in ciascuno strato (EGL, ML ed IGL) è stato espresso come percentuale del numero totale di cellule BrdU+ presenti in tutti e tre gli strati. I conteggi sono stati effettuati su sezioni sagittali non adiacenti a metà del quinto, del settimo e del nono folia, analizzando cinque sezioni per animale e tre animali per genotipo. Similmente, negli esperimenti di migrazione dalle lesioni, il numero di cellule BrdU+ è stato contato nella lesione ed in ciascuno strato ad essa adiacente (ML ed IGL) ed espresso come percentuale del numero totale di cellule BrdU-marcate. I conteggi sono stati effettuati in tre sezioni sagittali non adiacenti per lesione.

Misurazioni planimetriche dell’area delle lesioni sono state eseguite attraverso l’uso del software I.A.S. su sezioni sagittali adiacenti contenenti l’intera estensione della lesione preneoplastica, tracciando il profilo della lesione su un’immagine digitale (ingrandimento 5×). Il volume di ciascuna lesione, quindi, è stato calcolato moltiplicando l’area media della lesione per lo spessore delle sezioni (40 μm) e per il numero di sezioni nelle quali la lesione è stata osservata.