Cytome-test del micronucleo con blocco della citodieresi (CBMN-cyt)

Il Cytome-test del micronucleo consente di valutare diverse tipologie di aberrazioni cromosomiche indicate dalla presenza di micronuclei, ponti nucleoplasmatici ed evaginazioni nucleari, contestualmente alla stima degli effetti citostatici e citotossici indotti dalle nanoparticelle di TiO2 pristine, silicate e citrate, e del

materiale di riferimento P25.

4x104 A549/pozzetto sono state messe in coltura in piastre a 6 pozzetti (9.5 cm2 di superficie di coltura; Falcon, Italia). Dopo 24 ore di incubazione le piastre di coltura sono state trattate con 10-20-40 µg/cm2 di TiO2 NP, con i rispettivi controlli

solvente e con 0.1 µg/mL di mitomicina-C (Sigma-Aldrich, Italia) come controllo positivo. Dopo 44 ore dalla messa in coltura delle cellule sono stati aggiunti 6

g/mL di citocalasina-B (Sigma-Aldrich, Italia) per garantire il blocco della citodieresi e quindi la formazione di cellule binucleate.

Dopo 72 ore dall’inizio dell’esperimento è stato effettuato il recupero delle cellule: è stato aspirato il mezzo di coltura contenente le TiO2 NP e, dopo opportuni

lavaggi, le cellule sono state tripsinizzate, trasferite in tubi a fondo conico da 15 mL (Falcon, Italia) e centrifugate per 10 minuti a 1000 rpm. È stato quindi eliminato il surnatante ed effettuato un lieve trattamento ipotonico risospendendo le cellule per 1 minuto in 5 mL di soluzione ipotonica (KCl 0.075 M) precedentemente posta a 37°C. Sono stati aggiunti quindi 400 L di prefissativo (miscela di metanolo e acido acetico in rapporto 3:5) al fine di bloccare l’azione della soluzione ipotonica e, dopo aver risospeso le cellule, è stata effettuata una nuova centrifugazione (1000 rpm per 10 minuti). Il surnatante è stato poi rimosso e le cellule sono state risospese in 10 mL di metanolo assoluto a -20°C.

Al momento dell’allestimento dei vetrini è stata effettuata un’ulteriore centrifugazione (10 minuti, 1000 rpm) e, eliminato il surnatante, le cellule sono state risospese in 10 mL di soluzione fissativa composta da metanolo e acido acetico (rapporto 6:1) a -20°C. Il pellet ottenuto con una nuova centrifugazione è stato risospeso in fissativo fresco e circa 80 L di sospensione cellulare sono stati depositati su vetrini portaoggetto precedentemente lavati. Una volta asciutti, i vetrini sono stati posti per circa 15 minuti all’interno di vasi di Coplin contenenti una soluzione al 2% di Giemsa (Sigma-Aldrich, Italia) tamponato a pH 7.4 con Sorensen’s buffer (NaH2PO4; K2HPO4). L’eccesso di colorazione è stato rimosso

effettuando un lavaggio in acqua deionizzata e i vetrini sono stati posti ad asciugare all’aria prima di procedere alla lettura dei preparati attraverso l’utilizzo di un microscopio ottico usando un ingrandimento 400X. L’analisi dei vetrini ed il conteggio delle cellule è stato eseguito secondo i parametri indicati da M. Fenech (2007).

3.5.1 Criteri di conteggio delle cellule vitali e citostasi

L’osservazione dei vetrini mediante microscopio ottico consente di individuare cellule mono-, bi- e multi-nucleate che, affinché possano essere considerate vitali, devono presentare precise caratteristiche quali citoplasma intatto, quindi senza interruzione della membrana plasmatica, e nuclei con morfologia regolare. La presenza di eventuali biomarcatori di genotossicità (micronuclei, ponti nucleoplasmatici ed evaginazioni nucleari) non costituisce motivo di esclusione di tali cellule dal conteggio poiché non sono indicatori di non vitalità cellulare.

Gli effetti citostatici delle TiO2 NP e il tasso di proliferazione delle A549 in presenza

di titanio biossido sono stati valutati mediante il calcolo dell’indice di proliferazione cellulare (CBPI) che si ottiene dalla distribuzione del numero di cellule mononucleate (Mono), binucleate (BN) e multinucleate (Poly) secondo la formula:

CBPI = [(1 x Mono) + (2 x BN) + (3 x Poly)] / 500 cellule vitali

Per valutare gli effetti citostatici delle TiO2 NP è stato utilizzato anche l’indice di

replicazione (RI) che indica il numero relativo di nuclei in colture trattate rispetto alle colture di controllo non trattate e può essere usato per calcolare la % di citostasi mediante la seguente formula:

RI = [(1 x BN) + (2 x Poly)] / 500 cellule trattate / [(1 x BN) + (2 x Poly)] / 500 cellule non trattate x 100

Rispetto al CBPI, l’indice di replicazione esprime valori in percentuale e ciò consente di paragonare i dati risultanti da diversi esperimenti, purché anche questi esprimano un valore di vitalità cellulare in percentuale.

3.5.2 Criteri di conteggio delle cellule non vitali e citotossicità

La citotossicità indotta dalle TiO2 NP e dai loro rispettivi controlli è stata valutata

attraverso l’analisi delle cellule non vitali, ossia di cellule apoptotiche e necrotiche. Le cellule apoptotiche sono cellule che vanno incontro a morte programmata e sono riconoscibili dalla presenza di cromatina condensata nel nucleo (apoptosi precoce) o di piccoli corpi nucleari (apoptosi tardiva). Nelle cellule apoptotiche la membrana citoplasmatica appare intatta e la colorazione della cromatina e del citoplasma è più intensa rispetto alle cellule vitali.

L’indice apoptotico è espresso come dato percentuale ed è calcolato come:

Per quanto concerne le cellule necrotiche, queste vanno incontro a morte cellulare a causa di danni alle membrane cellulari, ad organelli oppure a vie metaboliche essenziali per la loro sopravvivenza. Anche in questo caso possiamo distinguere uno stato di necrosi precoce, nel quale le cellule mostrano una colorazione citoplasmatica abbastanza chiara con presenza di numerosi vacuoli (principalmente nel citoplasma, talvolta nel nucleo), membrana citoplasmatica danneggiata e nucleo generalmente intatto, ed uno stato di necrosi avanzata dove il citoplasma appare danneggiato e/o irregolare e la membrana nucleare risulta solo parzialmente intatta con conseguente fuoriuscita di materiale nucleare. Caratteristica delle cellule necrotiche è che la colorazione di nucleo e citoplasma è, in genere, meno intensa rispetto a quella delle cellule vitali.

L’indice necrotico (%) viene calcolato come:

(numero cellule necrotiche / 500 cellule vitali) x 100

3.5.3 Criteri di valutazione del danno genotossico

Al fine di valutare il danno genotossico indotto in colture di A549 da TiO2 NP per

ciascun vetrino sono state analizzate un totale di 1000 cellule binucleate e 1000 cellule mononucleate con i seguenti criteri:

 i nuclei devono essere intatti e situati all’interno di un perimetro citoplasmatico ben definito

 i due nuclei delle cellule binucleate devono avere la medesima dimensione e intensità di colorazione, possono toccarsi ma non devono essere sovrapposti. Nel caso in cui sia presente sovrapposizione dei nuclei, la cellula può essere valutata e conteggiata solo se i confini nucleari sono ben definiti

 il confine citoplasmatico di una cellula deve essere intatto e ben distinguibile dal confine citoplasmatico delle cellule adiacenti.

I micronuclei (MN) sono morfologicamente identici ai nuclei, ma più piccoli: le loro dimensioni sono generalmente comprese tra 1/16 e 1/3 del diametro medio dei nuclei principali. Non sono rifrangenti, quindi sono ben distinguibili da artefatti

come macchie di colorante, e non sono collegati ai nuclei principali con i quali condividono una colorazione di pari intensità. Nel caso di contatto tra MN e nuclei principali, i confini di entrambi devono essere ben distinti in modo da poter stabilire con precisione l’assenza di collegamento tra i due.

La frequenza dei MN è ottenuta da mediante la formula:

numero MN / 1000 cellule binucleate

Con ponte nucleoplasmatico (NPB) si intende una struttura continua contenente DNA che collega i due nuclei di una cellula binucleata e la cui colorazione presenta le stesse caratteristiche di quella dei nuclei. I NPB hanno una larghezza variabile ma generalmente non superiore ad 1/4 del diametro dei nuclei principali. Seppure raramente, è tuttavia possibile visualizzare anche più di un NPB all’interno della stessa cellula binucleata. Una cellula binucleata contenete NPB, inoltre, può presentare anche uno o più MN contemporaneamente.

La frequenza di NPB è calcolata come

numero NPB / 1000 cellule binucleate

Le evaginazioni nucleari (NBUD) hanno la stessa morfologia dei MN, con i quali condividono le stesse caratteristiche di colorazione ma che risultano connessi al nucleo tramite un peduncolo.

La frequenza delle evaginazioni nucleari è ottenuta secondo la fomula:

numero NBUD / 1000 cellule binucleate