Degradazione dei tre isomeri dello xilene in Pseudomonas sp O

I ceppi batterici che degradano composti aromatici mostrano una rimarchevole versatilità metabolica dovuta ad un ampio range di substrati riconosciuti dagli enzimi catabolici. Questa bassa specificità di substrato porta alla degradazione di molecole tra loro correlate attraverso lo stesso pathway catabolico. Ne sono un esempio toluene, m- e p-xilene che vengono metabolizzati normalmente mediante la progressiva ossidazione del gruppo metilico che porta alla formazione di un acido metilbenzoico poi convertito a (metil)catecolo (TOL upper pathway) (Burlage et al., 1989). L’o-xilene, invece, non può essere degradato attraverso il TOL upper pathway poiché i derivati del toluene orto-sostituiti non sono substrati per la xilene monoossigenasi, il primo enzima di questa via catabolica.

Un’ulteriore versatilità metabolica può essere raggiunta mediante l’acquisizione di trasposoni catabolici che portano le informazioni genetiche per nuovi pathways. Inoltre, sequenze di inserzione ISs, possono contribuire alla versatilità metabolica dei batteri, in quanto determinano riarrangiamenti genomici che possono portare all’espressione di geni altrimenti silenti.

Pseudomonas sp. OX1 è in grado di crescere in presenza di toluene ed o-xilene, ma non può utilizzare m- e p-xilene come substrati di crescita. Infatti, quando il ceppo è esposto a questi composti, le cellule batteriche muoiono per l’accumulo di composti parzialmente ossidati: alcuni fenoli e catecoli prodotti attraverso le attività di ToMO e PH possono essere degradati solo molto lentamente o non venire affatto catabolizzati (Barbieri et al., 1993). È stato osservato che le attività di ToMO e della fenolo idrossilasi PH sono in grado di convertire m- e p-xilene in 3,5-dimetilcatecolo e in 3,6-dimetilcatecolo, rispettivamente. La C2,3O di Pseudomonas sp. OX1 rappresenta la “strettoia” per la successiva degradazione di questi intermedi: tale enzima è in grado di catalizzare la scissione dell’anello di molti intermedi (catecolo, 3- e 4-metilcatecolo, 3,4- e 4,5-dimetilcatecolo) derivati da toluene e o- xilene attraverso le due monoossigenazioni dirette da ToMO e da PH, per dare semialdeide 2- idrossimuconica, ma sembra incapace di catalizzare il taglio dei catecoli con due gruppi metilici nelle posizioni 3,5 e 3,6.

Il 3,5-dimetilcatecolo e il 3,6-dimetilcatecolo sono prodotti attraverso la progressiva ossidazione dell’anello aromatico che porta a m- e p-xilene cis-diidrodioli, poi deidrogenati nei rispettivi dimetilcatecoli, che si accumulano poiché non vengono metabolizzati dalla C2,3O, risultando tossici per la cellula (Arenghi et al., 2001; Barbieri et al., 1993 e 2000; Bertoni et al., 1996). Ciononostante, da colture di P. sp. OX1, sono stati isolati mutanti

utilizzare l’orto-isomero (Barbieri et al., 1993). Successivamente sono stati isolati dei revertanti in grado di crescere su tutti i tre isomeri dello xilene (Di Lecce et al., 1997).

È stato dimostrato che la degradazione dei due isomeri dello xilene procede attraverso il TOL pathway. Il processo consiste nella progressiva ossidazione del gruppo metilico, per arrivare alla formazione di monometilcatecoli non letali, superando la limitazione imposta dalla C2,3O (Barbieri et al., 1993; Bolognese et al., 1999).

Pseudomonas sp. OX1, a livello fenotipico, non mostra alcuna analogia con i ceppi TOL, ma porta tutte le informazioni genetiche richieste per il catabolismo di m- e p-xilene (fig. 27). Il mutante spontaneo Pseudomonas M1, infatti, porta i geni codificanti gli enzimi coinvolti nella degradazione dei due isomeri dello xilene, altamente omologhi ai geni xyl dell’upper pathway in pWW0 di P. putida mt-2. Questo mutante non è più in grado di utilizzare o-xilene come fonte di carbonio ed energia ma degrada m- e p-xilene catalizzando la progressiva ossidazione del gruppo metilico (fig. 27) (Barbieri et al., 1993).

Negli ambienti inquinati, i tre isomeri dello xilene sono solitamente presenti in miscela, perciò, la capacità di degradare i metilbenzeni può rappresentare un vantaggio per i batteri che colonizzano tali aree. È noto un solo esempio di batteri con tali caratteristiche. Il revertante Pseudomonas R1 mostra la capacità di degradare i tre isomeri dello xilene: presenta sia il TOL pathway per m- e p-xilene, che il TOU pathway per il catabolismo di o-xilene (fig. 27). Il catabolismo di m- e p-xilene, mediante il TOL pathway, procede attraverso la progressiva ossidazione del gruppo metilico per dare, rispettivamente, il 3- e il 4- metilbenzoato mentre, attraverso il TOU pathway, una piccola quantità dei due isomeri dello xilene viene trasformata nei corrispondenti dimetilfenoli (2,3- e 2,5-dimetilfenolo, rispettivamente), che non sono usati per la crescita e sono tossici per la cellula. È stato osservato, infatti, che i due dimetilfenoli intermedi sono successivamente convertiti da ToMO e PH in 3,5- e 3,6- dimetilcatecolo, non metabolizzati dalla C2,3O. Si ritiene che la produzione degli intermedi tossici sia la causa della rara presenza di tali revertanti negli ambienti contaminati dai metilbenzeni (Di Lecce et al., 1997). Il cometabolismo rappresenta, quindi, uno svantaggio evolutivo per il batterio che si trova in ambienti inquinati dai tre isomeri dello xilene e può essere aggirato mediante il silenziamento di uno dei due pathway catabolici. In Pseudomonas sp. OX1, infatti, i geni codificanti il TOL pathway sono inattivati dalla presenza di una sequenza di inserzione di 3kb, indicata come ISPs1. Questo elemento trasponibile è assente,

Sebbene il TOL pathway sia silente nel ceppo selvatico di Pseudomonas sp. OX1, la conservazione dei geni xyl nel genoma può conferire un vantaggio selettivo alla popolazione batterica. Tali geni rappresentano, infatti, una riserva di informazione genetica che, in seguito a cambiamenti delle condizioni ambientali, può assicurare la sopravvivenza di quei membri della popolazione che li esprimono. Tutto ciò si realizza attraverso un riarrangiamento genetico mediato dalla trasposizione e stimolato da condizioni di stress ambientale, generando, così, una grande variabilità genetica e contribuendo alla plasticità genomica di Pseudomonas sp. OX1. COOH CH3 Acido 2-metibenzoico CH3 CH3 o-xilene CH3 CH3 HO 2,3-dimetilfenolo R2 CH3 COOH R1 Acido 3-metilbenzoico CH₃ R1 m-xilene OH R₁ R₂ 2,3-dimetilfenolo

Acido 4-metilbenzoico p-xilene 2,5-dimetilfenolo

R2 R1=CH3 R2=H R2=CH3 R₁=H TOL Pathway TOU Pathway OX1 OX1 M1 M1 R1 R1

Figura 27. Catabolismo di o-, m- e p-xilene in Pseudomonas sp. OX1, M1 e R1