Plasmidi catabolici: il plasmide pWW0 e il plasmide pV

Alcuni ceppi appartenenti al genere Pseudomonas e altri batteri Gram-negativi correlati sono in grado di usare come fonte di carbonio composti aromatici, tra cui anche composti xenobiotici, grazie ad attività enzimatiche espresse da uno o più operoni catabolici localizzati su grandi plasmidi a basso numero di copie.

Il plasmide TOL, pWW0, di Pseudomonas putida mt-2 e il plasmide pVI150 di Pseudomonas sp. strain CF600 sono due classici esempi. Nel plasmide pWW0 mappano due operoni: il primo (upper pathway operon) codifica gli enzimi coinvolti nella trasformazione ossidativa del toluene e del m- e p-xilene al corrispondente benzoato e toluato, rispettivamente; il secondo (lower pathway operon) codifica gli enzimi che decidono il destino metabolico degli acidi carbossilici formatesi, a partire dall’apertura in posizione meta dell’anello aromatico fino alla formazione dei composti alifatici che entreranno nel ciclo degli acidi tricarbossilici (Worsey and Williams, 1975; Engesser et al., 1988; Kunz and Chapman, 1981). Il plasmide catabolico pVI150 di Pseudomonas sp. strain CF600 presenta un solo cluster genico, noto come dmp operon (di-methyl-phenol), per il catabolismo di fenolo e cresoli attraverso l’idrossilazione seguita da un meta-cleavage pathway (Shingler et al., 1989; Powlowski and Shingler, 1994).

Il plasmide pWW0 isolato da Pseudomonas putida mt-2 è stato il primo plasmide TOL ad essere identificato (Williams and Murray, 1974). Successivamente è stato isolato anche da Escherichia coli e da Erwinia chrysanthemi (Benson and Shapiro, 1978; Ramos-Gonzalez et al., 1991). Il plasmide (circa 117 Kb) è self-trasmissibile ed appartiene al gruppo di incompatibilità IncP-9. I geni catabolici e regolatori sono contenuti in una regione di circa 40 Kb. L’upper pathway, xylCMABN, codifica gli enzimi per la degradazione del toluene a benzoato, oltre ad una proteina di membrana codificata dal gene xylN (Harayama et al., 1986; Greated et al., 2002); il lower pathway è composto da 11 geni, xylXYZLTEGFJQKIH, che codificano gli enzimi per la degradazione del benzoato ad acetaldeide e piruvato. Il gene xylE codifica per la catecolo-2,3-diossigenasi che catalizza l’apertura dell’anello aromatico del catecolo Tale enzima appartiene alla classe delle catecolo diossigenasi extradioliche in quanto catalizza la conversione del catecolo a semialdeide 2-idrossimuconica, dando inizio ad un lower-meta pathway (Fig. 12).

CH3 CH2OH CHO Toluene Benzil alcool Benzaldeide COOH OH OH HOOC OH OH COOH OH O COOH COOH OH COOH COOH O COOH O COOH HO O Acido benzoico Acido carbossilico 1,2-diidrossiciclo-3-5-esadiene Catecolo Semialdeide 2-idrossimuconica 2-idrossi-2,4-esadiene-1,6-dioato CH3CCOOH O

Piruvato + CH₃CHO Acetaldeide 2-oxo-3-esadiene-1,6-dioato

2-oxopent-4-enoato

4-idrossi-2-oxovalerato

xylMA Xilene ossigenasi

xylB Benzil alcool deidrogenasi

xylC Benzaldeide deidrogenasi

xylD Toluato ossigenasi

CO2 xylL Diidrossicicloesadiene carbossilato deidrogenasi xylE Catecolo-2,3-ossigenasi xylG Semialdeide 2-idrossimuconica deidrogenasi xylH 4-oxalocrotonato isomerasi CO2 xylI 4-oxalocrotonato decarbossilasi HCOOH xylF

Semialdeide 2-idrossimuconica idrolasi

xylJ 2-oxopent-4-enoato idratasi

xylK 4-idrossi-2-oxovalerato aldolasi

CH3CO-CoA Acetil-CoA

xylQ acetaldeide deidrogenasi acetilante xylXYZ Toluato diossigenasi

A valle del lower pathway sono presenti due geni di regolazione, xylS e xylR, coinvolti nel controllo trascrizionale degli operoni catabolici (Harayama et al., 1986; Greated et al., 2002). Le proteine regolatrici XylR e XylS appartengono rispettivamente alle famiglie NtrC (nitrogen-regulatory protein C) e AraC di attivatori trascrizionali batterici (fig. 13).

La proteina XylR è il regolatore principale dell’espressione dei geni catabolici xyl del plasmide TOL di P. putida mt-2 (Holtel et al., 1990). Il gene xylR è espresso costitutivamente a partire da due promotori σ70-dipendenti disposti in tandem: il promotore distale è detto Pr1 e quello prossimale è detto Pr2 (fig. 14). La proteina XylR è prodotta in forma inattiva: una volta che XylR ha interagito con molecole effettrici quali toluene, m- e p-xilene, substrati per l’upper pathway, passa dalla conformazione inattiva alla conformazione attiva e agisce come regolatore positivo attivando la trascrizione dal promotore Pu (σ54-dipendente) dell’upper pathway. Inoltre la proteina XylR attiva innesca la trascrizione dal promotore Ps1 (σ54- dipendente), uno dei due promotori del gene xylS. I due promotori del gene xylS sono uno prossimale Ps2 (σ70-dipendente) e uno distale Ps1 (σ54-dipendente) (fig. 14). In assenza di idrocarburi aromatici, il gene xylS è espresso ad un livello costitutivo basso a partire dal promotore Ps2 σ70-dipendente. In presenza di induttori aromatici, la proteina XylR attiva si lega alle sequenze attivatrici a monte (UASs) del promotore Ps1 σ54-dipendente aumentando il livello di espressione di xylS, senza variare il suo livello di trascrizione dal promotore Ps2 (fig. 13). Il risultato è un’espressione aumentata della proteina XylS che stimola la trascrizione dal promotore Pm dell’operon meta del plamide TOL (Gallegos et al., 1996): l’azione regolatoria di XylS è dipendente dalla proteina regolatoria XylR.

La proteina XylR, oltre ad essere un attivatore trascrizionale, reprime la sua stessa espressione. Infatti, in presenza di induttori aromatici, l’autorepressione di XylR aumenta (Bertoni et al., 1998b; Marqués et al., 1998). Questa autorepressione sembra essere causata dal fatto che i promotori Pr1 e Pr2 di xylR e le UASs, a cui si lega XylR a monte del promotore Ps1 del gene xylS (fig. 14), si sovrappongono e questo può impedire il legame della RNAP-σ70 ai promotori di xylR (Tropel and van der Meer, 2004).

Figura 13. I due geni regolatori xylR e xylS sono localizzati a valle dell’operon meta e

regolano la trascrizione degli operoni catabolici del plasmide TOL di P. putida mt-2. Il gene xylS è trascritto divergentemente rispetto all’operon meta. La proteina XylR, in seguito all’interazione con un induttore chimico, come xilene, si attiva ed innesca la trascrizione da Pu, aumenta la trascrizione da Ps e autoreprime la sua stessa trascrizione. XylS promuove l’espressione dell’operone meta.

xilene

U

UUppppppeeerrr

o

oopppeeerrrooonnn

M

MMeeetttaaa

o

oopppeeerrrooonnn

xyl

xyl

xyl

xyl

Pu

Pm

Ps

Pr

-

+

+

+

XylR XylR XylR

Risultati sperimentali (Marqués et al., 1998) mostrano che l’autoregolazione è più forte in presenza dell’effettore. Sono proposte due spiegazioni per questa scoperta:

1) il legame di un effettore a XylR può aumentare l’affinità del regolatore per le sue