3.2 Realizzazione del vettore di espressione pET-HOA
3.9 Saggi di attività enzimatica per testare l’attività della deidrogenasi ADA
Gli enzimi ADA ed HOA si associano a formare un complesso grazie al quale l’acetaldeide, prodotta dall’aldolasi HOA e tossica per la cellula, viene direttamente incanalata verso il sito attivo della deidrogenasi ADA. Studi di attività enzimatica condotti sulle proteine omologhe di Pseudomonas sp. CF600, chiariscono che i due enzimi sono attivi soltanto se associati a formare un complesso bifunzionale. In particolare sembra che HOA possa svolgere la sua attività enzimatica solo se complessata ad ADA, mentre bassi livelli di attività possono essere registrati anche se ADA viene espressa in assenza della sua controparte.
A causa della difficoltà legata alla sintesi del substrato di HOA, necessario per lo studio della sua attività e per investigare la possibilità del channeling tra i due enzimi, durante questo lavoro di tesi l’attenzione è stata concentrata su ADA ed in particolare sulla messa a punto di condizioni che permettano di saggiare la sua attività a partire da un campione proteico molto complesso quale un estratto totale da E. coli ricombinante. L’uso di enzimi non purificati rende particolarmente difficile stabilire quali siano le quantità ottimali di estratto proteico e dei cofattori da usare nel saggio.
Sono stati realizzati una serie di saggi che hanno permesso una prima valutazione della Km per l’acetaldeide che si può definire approssimativa dato che non sono stati condotti saggi sull’enzima purificato ma sull’estratto proteico totale di un ceppo di E. coli esprimente l’enzima d’interesse.
Risulta chiaro che, in assenza di test relativi ad HOA, questi dati non permettono di dimostrare il corretto assemblaggio e funzionamento del complesso enzimatico bifunzionale ADA-HOA ricombinante.
Studi condotti sulle proteine omologhe di E. coli K12, hanno messo in evidenza che la deidrogenasi ADA (MphF) funziona come una proteina chaperon per il corretto folding della aldolasi HOA (MphE). Sembra che l’espressione delle due proteine sia unita ad un meccanismo che previene un eccesso di produzione di MphE, che non può assumere la sua conformazione nativa in assenza di MphF.
Quanto riportato per le proteine MphF e MphE di E. coli K12 ed il valore di Km registrato nei nostri saggi, molto simile alla Km per l’acetaldeide trovata per ADA wilde-type di Pseudomonas CF600, può far ipotizzare che l’aldolasi HOA sia presente nei nostri campioni e possa formare un complesso con ADA funzionalmente attivo. Se così non fosse
dell’assenza o dell’inattività di HOA.
Prove di attività enzimatica sono state eseguite sia sui campioni proteici derivanti dalla purificazione dei corpi d’inclusione sia sui supernatanti recuperati subito dopo il frazionamento delle cellule che esprimono i costrutti con e senza il peptide segnale.
È stata registrata una scarsa attività enzimatica sia per le proteine rinaturate dai corpi d’inclusione che per quelle presenti nel supernatante relative al campione da BL21(DE3) esprimente il plasmide pET-FG-Nco/B, mentre una buona attività della deidrogenasi ADA è stata riscontrata nel supernatante del campione da BL21(DE3) esprimente il plasmide pET- FG-Nde/B: si è allora scelto di utilizzare quest’ultimo campione per l’esecuzione di una serie di saggi di attività enzimatica volti a determinare le costanti cinetiche, KM e Vmax , di ADA. Le
reazioni sono state monitorate a 340 nm misurando la quantità di NADH che si produce dalla riduzione del NAD+ e che equivale alla quantità di substrato che l’enzima consuma. In questi saggi sono state mantenute costanti le concentrazioni di βNAD+ e CoA ed è stata variata la concentrazione del substrato acetaldeide. I valori di assorbanza/minuto (∆A340/minuto),
ottenuti dalle varie prove, sono stati convertiti in µM/minuto usando la relazione indicata nella sezione 2.19.2 di Materiali e Metodi ed i dati ottenuti sono stati riportati in un grafico, mostrato in figura 47, che descrive un’iperbole equilatera secondo l’equazione di Michaelis- Menten.
Poiché l’equazione suddetta per il calcolo delle costanti cinetiche, KM e Vmax non
fornisce valori precisi per alte concentrazioni di substrato, si è fatto uso di una trasformazione lineare dell’equazione di Michaelis-Menten, definita dall’equazione di Hanes. È stato così costruito il grafico mostrato in figura 48 che ci ha permesso di definire una KM di ADA per
l’Acetaldeide pari a 37.6 mM, per intersezione della retta con l’asse delle ascisse, ed una Vmax
pari a 21.15 µM/minuto, ottenuta sapendo che l’intercetta con l’asse delle ordinate, che vale 1.78, è pari a KM/Vmax .
Sono in corso ulteriori saggi per la determinazione della KM dell’enzima in relazione ai
cofattori NAD+ e CoA, allo scopo di definire con precisione il meccanismo cinetico della deidrogenasi.
0 5 10 15 20 25 0 50 100 150 200 250 300 350 400 [ S ] mM V o ( µ M /m in u to )
Figura 47: Curva di Michaelis-Menten. Effetto della concentrazione del substrato
Acetaldeide sulla velocità iniziale della reazione catalizzata da ADA. La curva è stata ottenuta eseguendo saggi con 1,25 µg di estratto proteico totale, 1,425 mM di βNAD+, 0,5 mM di Coenzima A (CoA), 50 mM di sodio fosfato buffer a pH 7,5 e con concentrazioni crescenti di acetaldeide comprese tra 5 mM e 350 mM.
-10 -5 0 5 10 15 20 -100 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 [ S ] mM [ S ] / V o
Figura 48: Grafico lineare di Hanes per il calcolo dei parametri cinetici KM e Vmax
della Deidrogenasi ADA rispetto al substrato acetaldeide. Il grafico è stato realizzato con i dati precedentemente utilizzati per la costruzione della curva di Michaelis- Menten.
X intercetta quando Y=0 : -37,6 questo valore definisce la Km