Densità delle spine dendritiche in età adulta

Per prima cosa abbiamo comparato la densità delle spine dendritiche nei topi adulti WT e KO per la proteina CDKL5. La Figura 16 mostra tale dato per i due genotipi misurato a 5 intervalli tra P50 e P80. I dati sono stati ottenuti acquisendo le immagini di dendriti di 7 topi WT e 8 topi KO per un totale di 26 dendriti per ogni genotipo e sono stati analizzati mediante un ANOVA a due vie per misure ripetute.

E’ stata riscontrata una grande differenza tra i due genotipi con la densità di spine che scende da 1.34 spine per micron del WT a 0.75 spine per micron nel mutato

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(Figura 16). La differenza tra i due genotipi è molto marcata e corrisponde ad un decremento di circa il 44%. L’analisi statistica ha confermato un effetto principale del genotipo (F(1,14) =26.47, p<0.001). L’analisi ha altresì evidenziato come il tempo è

un fattore che ha un effetto significativo sulla densità delle spine dendritiche (F(4,56)=4.58, p=0.003). L’interazione tra i due fattori, infine, (genotipo × età) non è

invece significativa (F(4,56)=0.067, p=0.62).

Figura 16Densità delle spine dendritiche nel topo adulto. I Topi KO per CDKL5 mostrano una riduzione della densità delle spine dendritiche rispetto ai controlli. Sono stati anche eseguiti multipli t-test prendendo in esame i dati dei due genotipi a vari giorni ed il loro risultato è sintetizzato mediante l’utilizzo di asterischi (*** = p<0.001).

La figura 17 mette a confronto i dati sulla densità delle spine dei topi adulti con la tecnica della “cranial window” e i dati ottenuti nella prima parte della tesi sui topi nell’età dello sviluppo (P27) con la tecnica dell’assottigliamento cranico. Anche se l’utilizzo di due tecniche diverse può introdurre differenze nella stima del numero assoluto di spine (Xu et al 2007) il pattern che emerge sembra essere comunque

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degno di nota. Infatti, mentre nei topi WT il periodo che va da P27-P50 non sembra essere caratterizzato da forti cambiamenti sul numero di spine (entrambi pari a 1,39 spine per micron), il topo privo della proteina CDKL5 va incontro ad una forte diminuzione da 1,14 a 0,83 spine per micron di dendrite (il 27% in meno). Questo dato rafforza e complementa quello riportato nella prima parte della tesi (Fig 12A) che aveva evidenziato dei deficit nella stabilizzazione delle spine. In quel caso era stato misurato un tasso di perdita tra P27 e P28 più elevato dei topi WT. Qui si registra un forte ed irrecuperabile decremento del numero di spine.

Figura 17 Confronto sulla densità delle spine tra periodo critico e fase adulta.Nei topi KO per CDKL5 si osserva una forte diminuzione della densità delle spine dendritiche durante il periodo che va da P27 a P50. Tale diminuzione non si verifica durante le sessioni di imaging successive, per cui la ridotta densità delle spine dendritiche nel topo adulto è dovuta alle alterazioni che si verificano durante il periodo critico (**=p<0.01, *** = p<0.001).

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2.2 Turnover nel topo adulto misurato tra P50-P54

Abbiamo misurato il turnover delle spine dendritiche nei topi wt e KO CDKl5 in un periodo di quattro giorni, nell’età che va da P50 a P54.

Abbiamo scelto un protocollo di imaging diverso da quello usato nei topi durante lo sviluppo ( vedi paragrafo 2.2) in quanto trascorsa l’età dello sviluppo, le dinamiche di maturazione dei circuiti neuronali sono caratterizzati da tempistiche più lente..

Abbiamo ossevato che non ci sono differenze significative nei due gruppi sperimentali (figura18) sia per quanto riguarda la frazione di spine nate, sia per la frazione di spine perse, indicando che la proteina CDKL5, nel periodo adulto, non modula i processi di formazione/eliminazione delle spine a breve termine(Medie spine nate: Mediawt = 0.12, sem ± 0.024; MediaKO = 0.10, sem ± 0.042; p>0.05;

Medie spine perse: Mediawt = 0.17, sem ± 0.041; MediaKO = 0.12, sem ± 0.026;

p>0.05; t-test). .

.

Figura 188 .Analisi del turnover nei topi wt e Ko CDKL5 nel periodo adulto. I processi di formazione e di eliminazione sono simili tra i due genotipi (n = 7 per i topi wt e n= 9 per i topi KO).

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2.3 Analisi di sopravvivenza delle spine nel topo adulto.

Gli esperimenti finora effettuati sul topo adulto ci permettono di calcolare il tasso di sopravvivenza delle spine da P50 fino a P80. A tal fine vengono marcate le protrusioni presenti al primo giorno di imaging e viene calcolata in funzione del tempo la frazione di spine che sono sopravvissute fino alle successive sessioni di imaging.

La figura 19 riporta questo dato per i due genotipi in tutto il periodo che va da P50 a P80.

Il pattern di dati ha un tipico andamento decrescente che può essere catturato da un fit esponenziale. Nello specifico abbiamo utilizzato una funzione esponenziale con due parametri S e τ che segue la seguente equazione:

In questa equazione i due parametri descrivono due caratteristiche diverse del processo di eliminazione delle spine; S indica l’asintoto della curva ossia il valore di spine residue dato un tempo molto elevato, τ invece indica quanti giorni devono trascorrere affinché il processo di eliminazione di spine abbia raggiunto un valore prefissato ovvero aver perso il 63% delle spine che andranno incontro ad eliminazione. Il fit misurato sui valori medi di sopravvivenza delle spine dei diversi topi ha restituito i seguenti valori dei parametri S e τ. I valori di significatività ottenuti mediante t-test sono riportati nell’ultima colonna.

(

S

)

e

S

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parametro CDKL5+/y CDKL5-/y p-value

S 0.72±0.041 0.63±0.013 0.0038

Τ 4.15±1.21 9.07±1.77 0.0044

Tabella 2 Valori dei parametri del fit esponenziale per i due genotipi. I valori medi dei parametri S e τ dei fit sui dati dei singoli topi sono riportati nelle rispettive colonne. Nell’ultima colonna viene riportato il valore di significatività del t-test .

Questi dati indicano nel complesso che le spine dei topi mutati sono meno stabili (S è inferiore) e che le dinamiche dei processi di eliminazione sono più lenti (τ maggiore nei mutati).

59 Figura 19 Sopravvivenza delle spine nell’età adulta. Il fit esponenziale riporta con i simboli

i dati grezzi di sopravvivenza delle spine acquisite al giorno P50 e poi monitorate ad un lasso di tempo regolare (4, 8, 15 e 30 giorni), corrispondenti a P54, P58, P65 e P80. Le due curve continue sono le funzioni esponenziali che fittano meglio i dati di ciascun genotipo (per dettagli vedi il testo).

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