La Sindrome di Rett (RTT) è una grave patologia neurologica progressiva con esordio molto precoce caratterizzata da arresto dello sviluppo neurologico, declino cognitivo, disturbi motori e frequenti convulsioni (Hagberg et al 1983). Sebbene il 90% dei casi di RTT siano causati da mutazioni del gene MeCP2, recentemente sono state identificate mutazioni del gene CDKL5 in pazienti ai quali è stata diagnosticata la RTT atipica (Elia et al 2008).
L‘alterazione cerebrale responsabile dei sintomi della patologia non è tuttavia ancora
conosciuta. I lavori più recenti, grazie alla produzione di numerosi modelli animali della RTT classica, mostrano che i siti di alterazione più probabili sono le sinapsi, cioè i punti di contatto tra i neuroni che mediano la trasmissione dei segnali nervosi tra una cellula e l’altra. Nel caso delle mutazioni nel gene MeCP2 vi sono numerose indicazioni che queste strutture siano alterate a livello morfologico, molecolare e funzionale nel modello animale. Inoltre è stato suggerito che la mutazione di MeCP2 colpisce anche la plasticità sinaptica ovvero la capacità di modificare forma e
funzione delle sinapsi in risposta a stimoli esterni(Landi et al 2011).
Non era tuttavia noto se anche la mutazione del CDKL5 alterasse la dinamica delle spine dendritiche. Per verificare questa ipotesi ci siamo avvalsi del modello animale creato dal gruppo del prof. Cornelius Gross (EMBL di Roma) che rappresenta un nuovo modello murino con delezione del gene CDKL5 (Morello et al 2013).
In questo lavoro di tesi, abbiamo utilizzato la microscopia a due fotoni, una tecnica che permette di seguire la vita delle spine dendritiche dalla loro formazione alla loro retrazione fino alla stabilizzazione finale. Nello specifico, la microscopia a 2 fotoni permette di ottenere scansioni tridimensionali di una porzione di tessuto nervoso senza sviluppare né neurotossicità né alterazioni dei tessuti stessi. Pertanto essa
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consente di osservare in vivo lo stesso dendrite di uno stesso animale per un periodo che va dalle poche ore a mesi.
Nella prima parte del lavoro di tesi, abbiamo condotto le nostre analisi delle spine dendritiche durante il periodo critico, periodo nel quale i circuiti nervosi presentano la massima capacità di adattarsi al cambiamento degli stimoli ricevuti.
Dato che in questo periodo i processi neuronali sono molto più rapidi, ci è bastato analizzare l’intervallo di tempo tra P27- P28 per ottenere una misura rappresentativa del numero e della dinamica delle spine dendritiche. Nel nostro lavoro abbiamo trovato che il topo KO-CDKL5 presenta profonde alterazione a carico dei contatti sinaptici. Da un lato abbiamo dimostrato che il topo KO ha una densità di spine molto inferiore al controllo (circa il 18%). Dall’altro abbiamo visto che il tasso di perdita di spine è particolarmente elevato (il doppio dei WT). Al contempo il tasso di produzione di nuove spine è pari al controllo. Questo indica che la proteina CDKL5 ha un ruolo importante non tanto nella formazione di nuove spine dendritiche quanto nella stabilizzazione delle stesse, con i mutanti che falliscono nel consolidare i contatti sinaptici. Un deficit nella stabilizzazione delle spine sembrerebbe essere compatibile anche con l’analisi separata del numero di filopodi e spine. I filopodi sono i precursori delle spine ed il loro numero è un buon indice della capacità dei neuroni di produrre un primo sito post-sinaptico in risposta a nuove stimolazioni esterne. Le spine sono i contatti più stabili ed acquisiscono la loro forma finale dopo una fase di stabilizzazione accompagnata da diversi cambiamenti strutturali interni al contatto sinaptico (Hayashi & Majewska 2005). I nostri dati indicano che il numero di filopodi è molto simile nei due genotipi (Figura 12) indicando che i processi che producono una prima rapida risposta sinaptica sono indipendenti dalla CDKL5. In contrasto con ciò, è invece il numero di spine vere e proprie, i contatti più maturi, che è inferiore nel modello KO-CDKL5. Il deficit nella stabilizzazione delle spine è stato confermato anche con altri esperimenti di espressione proteica con i quali abbiamo misurato i livelli di espressione della PSD-95, proteina post-sinaptica importante per il mantenimento delle sinapsi eccitatorie (Elias & Nicoll 2007). Nei nostri dati è risultato che i topi KO per la CDKL5 hanno livelli di PSD-95 inferiori del 29% rispetto ai wild type (Figura15). Questi dati sembrano essere in accordo con un
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recente studio, dove è stato dimostrato che la proteina CDKL5 interagisce con il complesso NGL1-PSD95 per regolare la forza delle sinapsi. (Ricciardi et al 2012)
E’ interessante notare come il nostro dato suggerisca che CDKL5 agisca in modo diverso dall’altro gene coinvolto nella RTT classica (MeCP2). Un recente studio (Landi et al) ha dimostrato che nel modello murino della RTT classica la maggiore alterazione è nei pathway che portano alla formazione dei contatti sinaptici mentre il CDKL5 sembrerebbe esclusivamente coinvolto nella stabilizzazione sinaptica. Quindi, sebbene le mutazioni di MeCP2 e CDKL5 portino alla fine entrambe ad una riduzione delle spine, il meccanismo di azione potrebbe essere diverso.
Nella seconda parte del lavoro abbiamo analizzato il numero e la sopravvivenza delle spine dendritiche nel topo adulto. Trascorsa l’età dello sviluppo, i processi di maturazione dei circuiti neuronali sono caratterizzati da dinamiche più lente. Pertanto abbiamo selezionato un protocollo di imaging che permette sessioni di acquisizione a distanza di diversi giorni. A tal fine abbiamo sottoposto gli animali all’impianto di una finestra cranica, tecnica che garantisce un accesso ottico inalterato nel tempo ed abbiamo seguito i topi da P50 a P80 con sessioni di imaging ad intervalli prestabiliti. I nostri risultati hanno mostrato che la densità delle spine dendritiche nel topo adulto è notevolmente inferiore rispetto al controllo, suggerendo quindi che non intervengono meccanismi compensatori che riportano ai livelli del controllo la quantità di spine. Confrontando la densità delle spine a P27 e a P50 abbiamo inoltre osservato che il numero delle spine scende ulteriormente a P50 (Figura 17). Questo probabilmente è causato dai deficit nella stabilizzazione delle spine nel periodo critico misurate nella prima parte della tesi che, nel lungo termine, producono una forte riduzione del numero di spine.
Anche nel topo adulto abbiamo potuto effettuare analisi del turnover delle spine assimilabile a quello che si è condotto tra P27 e P28. In accordo con quanto trovato nel topo giovane, anche nell’adulto non vi sono sostanziali differenze nel tasso di produzione di nuove protuberanze sinaptiche (Figura 18), tuttavia non vi era un aumento della rimozione veloce delle spine dendritiche osservato durante lo
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sviluppo. Quindi questi dati suggeriscono che la proteina, in età adulta, non svolge un ruolo a breve termine, come invece dimostra l'analisi del turnover condotta nel topo giovane, in cui nell'arco di un giorno si osservava un forte aumento delle spine dendritiche perse (Figura 16).
Un’analisi più a lungo termine della stabilità delle spine dendritiche ha però mostrato che nell’adulto vi è una riduzione della percentuale di spine stabili per almeno un mese (spine persistenti). Confrontando il fit esponenziale della curva di sopravvivenza delle spine dendritiche abbiamo infatti trovato che le spine dei topi KO hanno un fattore di sopravvivenza (S) significativamente più basso rispetto al controllo. Ciò potrebbe derivare da un allungamento del periodo durante cui è presente la rimozione delle spine nel mutato che infatti raggiunge il valore finale di spine persistenti più tardi del topo WT. Anche la costante di tempo che regola la perdita delle spine (τ) sarebbe allungata. Quindi, la mancanza di CDKL5 rende più difficile la transizione a spina persistente ed in quanto tale protetta dai processi di eliminazione (tabella 1 e figura 19). I dati indicano complessivamente che, sebbene su tempi molto più lunghi del topo in sviluppo, anche nell’adulto il CDKL5 gioca un ruolo importante nella stabilizzazione delle spine dendritiche.
In conclusione, questo lavoro ha cercato di capire come la proteina CDKL5 influenza le spine dendritiche e le connessioni sinaptiche sia durante lo sviluppo che in età adulta. I nostri dati dimostrano che la proteina CDKL5 ha un ruolo cruciale nella stabilizzazione delle spine nel modello animale utilizzato, in particolare durante lo sviluppo. Lo studio delle vie di segnalazione molecolare coinvolte nella regolazione della stabilità delle spine dendritiche potrebbe quindi portare ad individuare fattori bersaglio per possibili trattamenti volti a migliorare il fenotipo dei topi mutanti per CDKL5 ed, in prospettiva, i sintomi delle pazienti.
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Bibliografia
Amir RE, Van den Veyver IB, Wan M, Tran CQ, Francke U, Zoghbi HY. 1999. Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG- binding protein 2. Nat Genet 23:185-8
Ariani F, Hayek G, Rondinella D, Artuso R, Mencarelli MA, et al. 2008. FOXG1 is responsible for the congenital variant of Rett syndrome. Am J Hum Genet 83:89-93
Belichenko PV, Oldfors A, Hagberg B, Dahlstrom A. 1994. Rett syndrome: 3-D confocal microscopy of cortical pyramidal dendrites and afferents. Neuroreport 5:1509-13
Belichenko PV, Wright EE, Belichenko NP, Masliah E, Li HH, et al. 2009. Widespread changes in dendritic and axonal morphology in Mecp2-mutant mouse models of Rett syndrome: evidence for disruption of neuronal networks. J Comp Neurol 514:240-58
Bradford MM. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 72:248-54
Chahrour M, Jung SY, Shaw C, Zhou X, Wong ST, et al. 2008. MeCP2, a key contributor to neurological disease, activates and represses transcription. Science 320:1224-9
Chahrour M, Zoghbi HY. 2007. The story of Rett syndrome: from clinic to neurobiology. Neuron 56:422-37
65
Chang Q, Khare G, Dani V, Nelson S, Jaenisch R. 2006. The disease progression of Mecp2 mutant mice is affected by the level of BDNF expression. Neuron 49:341-8
Chapleau CA, Calfa GD, Lane MC, Albertson AJ, Larimore JL, et al. 2009. Dendritic spine pathologies in hippocampal pyramidal neurons from Rett syndrome brain and after expression of Rett-associated MECP2 mutations. Neurobiol Dis 35:219-33
Chen Q, Zhu YC, Yu J, Miao S, Zheng J, et al. 2010. CDKL5, a protein associated with rett syndrome, regulates neuronal morphogenesis via Rac1 signaling. J Neurosci 30:12777-86
Chen RZ, Akbarian S, Tudor M, Jaenisch R. 2001. Deficiency of methyl-CpG binding protein-2 in CNS neurons results in a Rett-like phenotype in mice. Nat Genet 27:327-31
Cohen S, Gabel HW, Hemberg M, Hutchinson AN, Sadacca LA, et al. 2011. Genome-wide activity-dependent MeCP2 phosphorylation regulates nervous system development and function. Neuron 72:72-85
Dani VS, Chang Q, Maffei A, Turrigiano GG, Jaenisch R, Nelson SB. 2005. Reduced cortical activity due to a shift in the balance between excitation and inhibition in a mouse model of Rett syndrome. Proc Natl Acad Sci U S A 102:12560- 5
Della Sala G, Pizzorusso T. 2013. Synaptic plasticity and signaling in rett syndrome. Dev Neurobiol
Elia M, Falco M, Ferri R, Spalletta A, Bottitta M, et al. 2008. CDKL5 mutations in boys with severe encephalopathy and early-onset intractable epilepsy. Neurology 71:997-9
66
Elias GM, Nicoll RA. 2007. Synaptic trafficking of glutamate receptors by MAGUK scaffolding proteins. Trends Cell Biol 17:343-52
Feng G, Mellor RH, Bernstein M, Keller-Peck C, Nguyen QT, et al. 2000. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron 28:41-51
Fiala JC, Feinberg M, Popov V, Harris KM. 1998. Synaptogenesis via dendritic filopodia in developing hippocampal area CA1. J Neurosci 18:8900-11
Fiala JC, Spacek J, Harris KM. 2002. Dendritic spine pathology: cause or consequence of neurological disorders? Brain Res Brain Res Rev 39:29-54
Fichou Y, Nectoux J, Bahi-Buisson N, Chelly J, Bienvenu T. 2011. An isoform of the severe encephalopathy-related CDKL5 gene, including a novel exon with extremely high sequence conservation, is specifically expressed in brain. J Hum Genet 56:52-7
Grutzendler J, Kasthuri N, Gan WB. 2002. Long-term dendritic spine stability in the adult cortex. Nature 420:812-6
Hagberg B. 1985. Rett's syndrome: prevalence and impact on progressive severe mental retardation in girls. Acta Paediatr Scand 74:405-8
Hagberg B. 2005. Rett syndrome: long-term clinical follow-up experiences over four decades. J Child Neurol 20:722-7
Hagberg B, Aicardi J, Dias K, Ramos O. 1983. A progressive syndrome of autism, dementia, ataxia, and loss of purposeful hand use in girls: Rett's syndrome: report of 35 cases. Ann Neurol 14:471-9
Hanashima C, Li SC, Shen L, Lai E, Fishell G. 2004. Foxg1 suppresses early cortical cell fate. Science 303:56-9
67
Hanefeld F. 1985. The clinical pattern of the Rett syndrome. Brain Dev 7:320-5
Hayashi Y, Majewska AK. 2005. Dendritic spine geometry: functional implication and regulation. Neuron 46:529-32
Holtmaat A, Wilbrecht L, Knott GW, Welker E, Svoboda K. 2006. Experience- dependent and cell-type-specific spine growth in the neocortex. Nature 441:979-83
Holtmaat AJ, Trachtenberg JT, Wilbrecht L, Shepherd GM, Zhang X, et al. 2005. Transient and persistent dendritic spines in the neocortex in vivo. Neuron 45:279-91
Hubel DH, Wiesel TN. 1962. Receptive fields, binocular interaction and functional architecture in the cat's visual cortex. J Physiol 160:106-54
Irwin SA, Patel B, Idupulapati M, Harris JB, Crisostomo RA, et al. 2001. Abnormal dendritic spine characteristics in the temporal and visual cortices of patients with fragile-X syndrome: a quantitative examination. Am J Med Genet 98:161-7
Johnston MV, Blue ME, Naidu S. 2005. Rett syndrome and neuronal development. J Child Neurol 20:759-63
Juttner R, Rathjen FG. 2005. Molecular analysis of axonal target specificity and synapse formation. Cell Mol Life Sci 62:2811-27
Kalscheuer VM, Tao J, Donnelly A, Hollway G, Schwinger E, et al. 2003. Disruption of the serine/threonine kinase 9 gene causes severe X-linked infantile spasms and mental retardation. Am J Hum Genet 72:1401-11
Kameshita I, Sekiguchi M, Hamasaki D, Sugiyama Y, Hatano N, et al. 2008. Cyclin- dependent kinase-like 5 binds and phosphorylates DNA methyltransferase 1. Biochem Biophys Res Commun 377:1162-7
68
Kennedy MB. 2000. Signal-processing machines at the postsynaptic density. Science 290:750-4
Kilstrup-Nielsen C, Rusconi L, La Montanara P, Ciceri D, Bergo A, et al. 2012. What we know and would like to know about CDKL5 and its involvement in epileptic encephalopathy. Neural Plast 2012:728267
Knott GW, Holtmaat A, Wilbrecht L, Welker E, Svoboda K. 2006. Spine growth precedes synapse formation in the adult neocortex in vivo. Nat Neurosci 9:1117-24
Kokura K, Kaul SC, Wadhwa R, Nomura T, Khan MM, et al. 2001. The Ski protein family is required for MeCP2-mediated transcriptional repression. J Biol Chem 276:34115-21
Landi S, Putignano E, Boggio EM, Giustetto M, Pizzorusso T, Ratto GM. 2011. The short-time structural plasticity of dendritic spines is altered in a model of Rett syndrome. Sci Rep 1:45
Mari F, Azimonti S, Bertani I, Bolognese F, Colombo E, et al. 2005. CDKL5 belongs to the same molecular pathway of MeCP2 and it is responsible for the early-onset seizure variant of Rett syndrome. Hum Mol Genet 14:1935-46
Matsuzaki M, Ellis-Davies GC, Nemoto T, Miyashita Y, Iino M, Kasai H. 2001. Dendritic spine geometry is critical for AMPA receptor expression in hippocampal CA1 pyramidal neurons. Nat Neurosci 4:1086-92
Matsuzaki M, Honkura N, Ellis-Davies GC, Kasai H. 2004. Structural basis of long- term potentiation in single dendritic spines. Nature 429:761-6
Mnatzakanian GN, Lohi H, Munteanu I, Alfred SE, Yamada T, et al. 2004. A previously unidentified MECP2 open reading frame defines a new protein isoform relevant to Rett syndrome. Nat Genet 36:339-41
69
Montini E, Andolfi G, Caruso A, Buchner G, Walpole SM, et al. 1998. Identification and characterization of a novel serine-threonine kinase gene from the Xp22 region. Genomics 51:427-33
Murmu RP, Li W, Holtmaat A, Li JY. 2013. Dendritic spine instability leads to progressive neocortical spine loss in a mouse model of Huntington's disease. J Neurosci 33:12997-3009
Murphy DB, Wiese S, Burfeind P, Schmundt D, Mattei MG, et al. 1994. Human brain factor 1, a new member of the fork head gene family. Genomics 21:551-7
Nan X, Meehan RR, Bird A. 1993. Dissection of the methyl-CpG binding domain from the chromosomal protein MeCP2. Nucleic Acids Res 21:4886-92
Nan X, Tate P, Li E, Bird A. 1996. DNA methylation specifies chromosomal localization of MeCP2. Mol Cell Biol 16:414-21
Neul JL, Kaufmann WE, Glaze DG, Christodoulou J, Clarke AJ, et al. 2010. Rett syndrome: revised diagnostic criteria and nomenclature. Ann Neurol 68:944-50
Nomura Y. 2005. Early behavior characteristics and sleep disturbance in Rett syndrome. Brain Dev 27 Suppl 1:S35-S42
Reiss AL, Faruque F, Naidu S, Abrams M, Beaty T, et al. 1993. Neuroanatomy of Rett syndrome: a volumetric imaging study. Ann Neurol 34:227-34
Rett A. 1966. [On a unusual brain atrophy syndrome in hyperammonemia in childhood]. Wien Med Wochenschr 116:723-6
Ricciardi S, Kilstrup-Nielsen C, Bienvenu T, Jacquette A, Landsberger N, Broccoli V. 2009. CDKL5 influences RNA splicing activity by its association to the nuclear speckle molecular machinery. Hum Mol Genet 18:4590-602
70
Ricciardi S, Ungaro F, Hambrock M, Rademacher N, Stefanelli G, et al. 2012. CDKL5 ensures excitatory synapse stability by reinforcing NGL-1-PSD95 interaction in the postsynaptic compartment and is impaired in patient iPSC-derived neurons. Nat Cell Biol 14:911-23
Roze E, Cochen V, Sangla S, Bienvenu T, Roubergue A, et al. 2007. Rett syndrome: an overlooked diagnosis in women with stereotypic hand movements, psychomotor retardation, Parkinsonism, and dystonia? Mov Disord 22:387-9
Rusconi L, Salvatoni L, Giudici L, Bertani I, Kilstrup-Nielsen C, et al. 2008. CDKL5 expression is modulated during neuronal development and its subcellular distribution is tightly regulated by the C-terminal tail. J Biol Chem 283:30101-11
Shepherd GM, Harris KM. 1998. Three-dimensional structure and composition of CA3-->CA1 axons in rat hippocampal slices: implications for presynaptic connectivity and compartmentalization. J Neurosci 18:8300-10
Spector DL, Lamond AI. 2011. Nuclear speckles. Cold Spring Harb Perspect Biol 3
Takashima S, Iida K, Mito T, Arima M. 1994. Dendritic and histochemical development and ageing in patients with Down's syndrome. J Intellect Disabil Res 38 ( Pt 3):265-73
Tolias KF, Bikoff JB, Burette A, Paradis S, Harrar D, et al. 2005. The Rac1-GEF Tiam1 couples the NMDA receptor to the activity-dependent development of dendritic arbors and spines. Neuron 45:525-38
Toni N, Teng EM, Bushong EA, Aimone JB, Zhao C, et al. 2007. Synapse formation on neurons born in the adult hippocampus. Nat Neurosci 10:727-34
Trachtenberg JT, Chen BE, Knott GW, Feng G, Sanes JR, et al. 2002. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature 420:788-94
71
Tropea D, Giacometti E, Wilson NR, Beard C, McCurry C, et al. 2009. Partial reversal of Rett Syndrome-like symptoms in MeCP2 mutant mice. Proc Natl Acad Sci U S A 106:2029-34
Waites CL, Craig AM, Garner CC. 2005. Mechanisms of vertebrate synaptogenesis. Annu Rev Neurosci 28:251-74
Williamson SL, Giudici L, Kilstrup-Nielsen C, Gold W, Pelka GJ, et al. 2012. A novel transcript of cyclin-dependent kinase-like 5 (CDKL5) has an alternative C- terminus and is the predominant transcript in brain. Hum Genet 131:187-200
Xu HT, Pan F, Yang G, Gan WB. 2007. Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex. Nat Neurosci 10:549-51
Yang G, Pan F, Parkhurst CN, Grutzendler J, Gan WB. 2010. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nat Protoc 5:201-8
Yang Y, Wang XB, Frerking M, Zhou Q. 2008. Spine expansion and stabilization associated with long-term potentiation. J Neurosci 28:5740-51
Yankova M, Hart SA, Woolley CS. 2001. Estrogen increases synaptic connectivity between single presynaptic inputs and multiple postsynaptic CA1 pyramidal cells: a serial electron-microscopic study. Proc Natl Acad Sci U S A 98:3525-30
Yao J, Lai E, Stifani S. 2001. The winged-helix protein brain factor 1 interacts with groucho and hes proteins to repress transcription. Mol Cell Biol 21:1962-72
Young JI, Hong EP, Castle JC, Crespo-Barreto J, Bowman AB, et al. 2005. Regulation of RNA splicing by the methylation-dependent transcriptional repressor methyl-CpG binding protein 2. Proc Natl Acad Sci U S A 102:17551-8
72
Yu F, Thiesen J, Stratling WH. 2000. Histone deacetylase-independent transcriptional repression by methyl-CpG-binding protein 2. Nucleic Acids Res 28:2201-6
Zappella M, Meloni I, Longo I, Hayek G, Renieri A. 2001. Preserved speech variants of the Rett syndrome: molecular and clinical analysis. Am J Med Genet 104:14-22
Zhou Q, Homma KJ, Poo MM. 2004. Shrinkage of dendritic spines associated with long-term depression of hippocampal synapses. Neuron 44:749-57.